[發明專利]一種抗諾龍的特異性抗體

無效

• 申請號: 201010237956.5
• 申請日: 2010-07-27
• 公開（公告）號: CN102336830A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發明（設計）人: 王碩;張燕;王俊平;王莉
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K14/795;C07K16/44;C07K16/06;C07J1/00;G01N33/535
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1.諾龍的人工抗原和抗體其特征在于使用分子式為

的17β-NT半抗原與BSA蛋白連接合成人工抗原，與辣根過氧化物酶連接合成酶標抗原，其中人工抗原再經過免疫新西蘭大白兔，取血，分離出抗血清純化制得抗體；

2.權利要求1所述的諾龍人工抗原的制備方法，其特征在于是用下述步驟制得：

(1)諾龍半抗原的合成步驟

精確稱取0.5488mg諾龍溶于13.5mL無水四氫呋喃中，加入0.4g丁二酸酐，0.55mL三乙胺和0.243mg?DMAP，60℃反應過夜，將溶劑懸蒸至干；

(2)半抗原的純化

將所得殘渣用有機溶劑乙酸乙酯/石油醚(1/1，v/v)溶解后，過層析柱純化。經過優化，最終選擇乙酸乙酯/石油醚(1/1，v/v)為展開劑。將得到的濾液旋蒸后得到白色晶體，即為17β-NT半抗原；

(3)人工抗原的合成

分別精確稱取上述所得17β-NT半抗原0.025mmol(9.36mg)和9.3mg?EDC，溶于1mLN-N二甲基甲酰胺(DMF)溶液中。將此溶液在冰浴中逐滴加入2mL濃度為5mg/mL的蛋白KLH溶液中(10mg?KLH溶于2mL?130mmol/L碳酸氫鈉緩沖液中，pH?8.1)，攪拌，室溫下反應5h；再精確稱取4.7mg?EDC加入反應液中，攪拌，4℃反應過夜，然后將反應液在4℃、pH?7.4的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中透析三天，然后精確量取蛋白質偶聯物溶液的體積，測定濃度加入疊氮鈉，分裝，-20℃保存；

3.權利要求1所述的諾龍酶標抗原的制備方法，其特征在于是用下述步驟制得：

權利2所得的17β-NT半抗原與HRP結合制成酶標抗原。方法與免疫抗原的制備方法相同：分別精確稱取上述所得17β-NT半抗原0.025mmol(9.36mg)和9.3mg?EDC，溶于1mLN-N二甲基甲酰胺(DMF)溶液中。將此溶液在冰浴中逐滴加入2mL濃度為5mg/mL的HRP溶液中(10mg?HRP溶于2mL?130mmol/L碳酸氫鈉緩沖液中，pH?8.1)，攪拌，室溫下反應5h；再精確稱取4.7mg?EDC加入反應液中，攪拌，4℃反應過夜，然后將反應液在4℃、pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中透析三天，然后精確量取酶標抗原溶液的體積，測定濃度加入硫柳汞，4℃保存；

4.權利要求1所述的諾龍抗體的制備方法，其特征在于是用下述步驟制得：

免疫動物選用雌性新西蘭大白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初免后進行四次加強免疫，加強免疫分別于初次免疫后2周、4周和6周后免疫三次，此后間隔一個月進行第五次免疫，免疫后9天由兔子的耳緣靜脈取血，進行效價檢測，具體做法是：

初次免疫：取1mg按照權利要求2所述方法合成的人工抗原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏完全佐劑等體積所配制的溶液中，進行動物免疫；

加強免疫：用0.5mg上述人工抗原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏不完全佐劑等體積所配制的溶液，進行動物免疫；

抗體純化：定時監測動物抗體效價，當抗體對一定的包被抗原達到適宜效價時，采集血液，并離心獲得抗血清，使用G-Sepharose蛋白親和層析柱對抗血清進行純化，獲得抗諾龍的特異性抗體。