[發(fā)明專利]一種靜電紡絲纖維膜固定化細胞檢測水中酚類物質(zhì)毒性的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010237591.6
• 申請日: 2010-07-27
• 公開（公告）號: CN101906459A
• 公開（公告）日: 2010-12-08
• 發(fā)明（設計）人: 牛軍峰;劉佳;蔣國翔;何天德;莊玲萍
• 申請（專利權）人: 北京師范大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12N1/20;C12N11/04
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• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發(fā)明屬于靜電紡絲纖維膜固定化細胞進行酚類物質(zhì)毒性檢測技術領域，具體涉及一種固定化細胞方法及其檢測酚類物質(zhì)毒性方法。

背景技術

酚類化合物是合成農(nóng)藥、染料、塑料抗氧劑等的重要精細化工中間體，被廣泛用于農(nóng)業(yè)、制藥業(yè)和染料等工業(yè)中，在生活污水、天然水和飲用水中普遍存在，是水體中的重要污染物，對生態(tài)環(huán)境和人體健康有著嚴重的危害。美國在七十年代中期就將11種酚類化合物列入129種環(huán)境優(yōu)先污染物之中，而我國也于八十年代末研究并提出了中國的環(huán)境優(yōu)先污染物，其中包括了6種酚類化合物。因此，對水體中酚類化合物的檢測具有非常重要的意義。

靜電紡絲技術是一種應用高壓電使帶電荷的高分子溶液或熔體在靜電場中流動或變形，然后由于溶劑蒸發(fā)或熔體冷卻而固化，最終產(chǎn)生直徑數(shù)十納米到幾十毫米的均勻纖維的過程。靜電紡絲納米纖維膜由于具有大的比表面積、高孔隙率和高吸附性能而被認為是一種較為理想的細胞固定化載體。直接將細胞與不同聚合物溶液進行混合，一同進行靜電紡絲，即本發(fā)明中所涉及的原位電紡。這種方法在保持細胞生存性的同時又能保持其以完整的結構包埋于纖維中，以使保護細胞免受極端條件限制的纖維內(nèi)部空間的優(yōu)勢得到充分發(fā)揮。DNA被包埋于靜電紡絲纖維中而應用于基因治療中。研究發(fā)現(xiàn)，直接從靜電紡絲纖維中釋放出的質(zhì)粒DNA相當完整，可以使細胞轉化，并且可以對β-牛乳糖酶的α部分進行編碼。細絲狀的細菌病毒懸浮于聚合物溶液進行靜電紡絲后仍然能夠保持其生存性。(Escherichia?coli，Staphylococcus?albus)和噬菌體(T7，T4，λ)在相當高的電壓下進行靜電紡絲，在紡絲過程中仍然存活，并且細菌和病毒在-20℃和-55℃放置三個月，其數(shù)量上沒有下降。結果表明，靜電紡絲過程運用于活的生物質(zhì)的包埋以及固定化的潛在可能性。而將這一技術應用于固定化細胞從而用于檢測酚類物質(zhì)毒性具有很現(xiàn)實的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種靜電紡絲纖維膜固定化細胞檢測水中酚類物質(zhì)毒性的方法，即利用靜電紡絲技術將大腸桿菌細胞直接固定于聚乙烯醇納米纖維中，該固定化大腸桿菌細胞在酚類存在的情況下其熒光強度的變化來檢測酚類物質(zhì)毒性的目的。此方法在于實現(xiàn)檢測的高通量和靈敏度，分析的速度較快，試樣用量少，且成本較低。

本發(fā)明是通過采用以下的技術方案來實現(xiàn)上述發(fā)明目的的：

本發(fā)明所提供的靜電紡絲纖維膜固定化細胞檢測水中酚類物質(zhì)毒性的方法是以高分子量的聚乙烯醇為原料，通過靜電紡絲技術制備得到電紡纖維膜固定化細胞，然后將此用于水中酚類物質(zhì)的檢測。該靜電紡絲纖維膜固定化細胞檢測水中酚類物質(zhì)毒性的方法，其特征在于：包括下列三個步驟：細胞的培養(yǎng)、電紡纖維膜固定化細胞的制備及利用其檢測水中酚類物質(zhì)毒性。

1)細胞的培養(yǎng)：

①取一管100μL?DH5a感受態(tài)細胞，加入綠色熒光蛋白質(zhì)粒1μL，混合均勻，冰浴中放置30min；

②將管放到42℃水浴循環(huán)，熱擊90s；

③將所述管轉移到冰浴中2～5min；

④向冰浴后的所述管中加入常溫下700～800μL無抗性的SOB培養(yǎng)基，轉入到搖床中，37℃下?lián)u動1h；

⑤取已轉化的感受態(tài)細胞450μL加入到50mg/L卡那霉素抗性的培養(yǎng)基上，等培養(yǎng)基全部吸收后，于37℃下培養(yǎng)12～16h；

⑥通過菌落PCR鑒定單菌落，確定含有能夠表達綠色熒光的蛋白的質(zhì)粒；

⑦PCR鑒定完畢無誤之后，挑選該單菌落接種于含有卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12～16h。

2)電紡纖維膜固定化細胞的制備：

將分子量為10萬的聚乙烯醇顆粒和嵌段共聚物溶于超純水中，均勻混合后加熱攪拌至澄清，待此溶液冷卻后，向其中加入一定量的步驟1)中培養(yǎng)的細胞，并將此混合溶液注入帶有針頭的5mL玻璃注射器，將注射器固定在注射泵上，紡絲電壓調(diào)節(jié)至13.2kV，針頭到接收板的距離設定為9cm，控制紡絲流速為0.2mL/h，紡絲時間3h，即得到所述電紡纖維膜固定化細胞。

3)利用電紡纖維膜固定化細胞檢測水中酚類物質(zhì)毒性：

將制備的固定有細胞的電紡纖維膜剪成1×1cm²大小相同的碎片放入96孔酶標板中，在對應的酶標板中以體積比為19∶1的比例加入一定濃度的酚類物質(zhì)與M9培養(yǎng)基，在37℃下每5min對其熒光吸收進行測定，據(jù)熒光吸收的變化來確定酚類物質(zhì)對細胞的毒性。