[發明專利]一種靜電紡絲纖維膜固定化細胞檢測水中酚類物質毒性的方法

無效

• 申請號: 201010237591.6
• 申請日: 2010-07-27
• 公開（公告）號: CN101906459A
• 公開（公告）日: 2010-12-08
• 發明（設計）人: 牛軍峰;劉佳;蔣國翔;何天德;莊玲萍
• 申請（專利權）人: 北京師范大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12N1/20;C12N11/04
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1.一種靜電紡絲纖維膜固定化細胞檢測水中酚類物質毒性的方法，其特征在于：包括下列三個步驟：細胞的培養、電紡纖維膜固定化細胞的制備及利用其檢測水中酚類物質毒性；

1)細胞的培養：

①取一管100μL?DH5a感受態細胞，加入綠色熒光蛋白質粒1μL，混合均勻，冰浴中放置30min；

②將管放到42℃水浴循環，熱擊90s；

③將所述管轉移到冰浴中2～5min；

④向冰浴后的所述管中加入常溫下700～800μL無抗性的SOB培養基，轉入到搖床中，37℃下搖動1h；

⑤取已轉化的感受態細胞450μL加入到50mg/L卡那霉素抗性的培養基上，等培養基全部吸收后，于37℃下培養12～16h；

⑥通過菌落PCR鑒定單菌落，確定含有能夠表達綠色熒光的蛋白的質粒；

⑦PCR鑒定完畢無誤之后，挑選該單菌落接種于含有卡那霉素抗性的LB培養基中，37℃培養12～16h。

2)電紡纖維膜固定化細胞的制備：

將分子量為10萬的聚乙烯醇顆粒和嵌段共聚物溶于超純水中，均勻混合后加熱攪拌至澄清，待此溶液冷卻后，向其中加入一定量的步驟1)中培養的細胞，并將此混合溶液注入帶有針頭的5mL玻璃注射器，將注射器固定在注射泵上，紡絲電壓調節至13.2kV，針頭到接收板的距離設定為9cm，控制紡絲流速為0.2mL/h，紡絲時間3h，即得到所述電紡纖維膜固定化細胞。

3)利用電紡纖維膜固定化細胞檢測水中酚類物質毒性：

將制備的固定有細胞的電紡纖維膜剪成1×1cm²大小相同的碎片放入96孔酶標板中，在對應的酶標板中以體積比為19∶1的比例加入一定濃度的酚類物質與M9培養基，在37℃下每5min對其熒光吸收進行測定，據熒光吸收的變化來確定酚類物質對細胞的毒性。

2.根據權利要求1中所述的方法，其特征在于：細胞的培養中所述的細胞為大腸桿菌，且其在利用電紡纖維膜固定化細胞檢測水中酚類物質毒性中大腸桿菌在孔板中的密度為1×10⁷個/cm²。

3.根據權利要求1中所述的方法，其特征在于：電紡纖維膜固定化細胞的制備中所述的聚乙烯醇的醇解度為98～99％，平均聚合度為2400～2500，其在水溶液中的質量分數為6％～8％。

4.根據權利要求1中所述的方法，其特征在于：電紡纖維膜固定化細胞的制備中所述的嵌段共聚物為聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚醚F108，其分子式為PEO132-PPO50-PEO132，分子量為15500克/摩爾。

5.根據權利要求1中所述的方法，其特征在于：利用電紡纖維膜固定化細胞檢測水中酚類物質毒性中培養基選用低熒光背景的M9培養基。

6.根據權利要求1中所述的方法，其特征在于：利用電紡纖維膜固定化細胞檢測水中酚類物質毒性中所述酚類物質為2，4-二氯酚和/或五氯酚。