[發(fā)明專利]經(jīng)血源性間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及其免疫調(diào)節(jié)作用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010237174.1
• 申請(qǐng)日: 2010-07-27
• 公開（公告）號(hào): CN101914494A
• 公開（公告）日: 2010-12-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 關(guān)方霞;周長輝;楊波;周云帆;田毅;谷晨熙;戴建武
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 鄭州大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/0775
• 分類號(hào): C12N5/0775;C12N5/0781;C12N5/0783
• 代理公司: 鄭州異開專利事務(wù)所(普通合伙) 41114
• 代理人: 王霞

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及具有自我更新能力和多向分化潛能的多能干細(xì)胞，尤其是涉及一種經(jīng)血源性間充質(zhì)干細(xì)胞(ERCs)的分離培養(yǎng)，本發(fā)明還涉及經(jīng)血源性間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。

背景技術(shù)

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具有低免疫原性、多向分化潛能及歸巢等優(yōu)點(diǎn)，是組織工程與細(xì)胞移植的重要種子細(xì)胞，被廣泛應(yīng)用于心血管疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、骨科類疾病及腎臟疾病等疾病的治療。

異體器官、組織及細(xì)胞移植引起的免疫排斥反應(yīng)及自身免疫性疾病是醫(yī)學(xué)工作者所面臨的難題，傳統(tǒng)藥物等治療方法無法根治該類疾病并可能引起嚴(yán)重的毒副作用。近年來，一些研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)具有獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)作用，可用于移植治療同源異體移植引起的免疫排斥反應(yīng)及自身免疫性疾病。一些研究發(fā)現(xiàn)，MSCs在心臟、腎臟、胰腺、肝臟等多種實(shí)體器官移植引起的免疫排斥反應(yīng)中以及造血干細(xì)胞移植導(dǎo)致的移植物抗宿主病(GVHD)中都具有良好的治療效果，可有效延長移植物生存時(shí)間，減輕免疫排斥反應(yīng)，提高移植成功率。在自身免疫性疾病治療方面，美國國家衛(wèi)生部已批準(zhǔn)MSCs應(yīng)用于治療移植物抗宿主病并進(jìn)入III期臨床階段。另外在歐洲和北美，MSCs也已被用于治療一些常見的自身免疫性疾病如全身性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等且已進(jìn)入I/II期臨床試驗(yàn)階段。而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的創(chuàng)傷性獲取及涉及的倫理、法律等問題又使其應(yīng)用受到了限制。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種新型MSCs來源的ERCs分離培養(yǎng)，并通過ERCs與植物凝集素(PHA)刺激下人外周血淋巴細(xì)胞及小鼠脾淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)及檢測免疫相關(guān)細(xì)胞因子的分泌情況對(duì)ERCs的免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了研究。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案：

本發(fā)明所述的經(jīng)血源性間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)，包括下述步驟：

第一步：培養(yǎng)基的配制

每390ml?DMEM高糖培養(yǎng)基加入100ml滅活后的無支原體胎牛血清、5ml10000U/ml的青/鏈霉素及5ml?0.25mg/ml的兩性霉素B，得到體積為500ml的培養(yǎng)基備用；

第二步：經(jīng)血源性間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

材料獲取：

取月經(jīng)血5ml，加入0.2ml?0.25mg/ml的兩性霉素B、0.2ml青/鏈霉素，0.1mlEDTA-Na2防止污染，在材料獲取24-48h內(nèi)進(jìn)行下述細(xì)胞分離；

細(xì)胞分離：

在15ml離心管中緩慢加入5ml比重為1.077的淋巴細(xì)胞分離液，將月經(jīng)血與等量PBS緩沖液充分混勻后，將經(jīng)血用滴管沿管壁緩慢疊加于淋巴細(xì)胞分離液分層液面上，細(xì)胞懸液與分離液兩者比例為1∶1或2∶1、2000rpm/min水平離心20min；離心后管內(nèi)液體分為四層，上層為血漿和PBS緩沖液，下層主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞，中層為淋巴細(xì)胞分離液，在上、中層交界處有單個(gè)核細(xì)胞層；用移液器吸取單個(gè)核細(xì)胞層置入另一15ml離心管中，加入5倍以上體積的PBS緩沖液，1200rpm/min離心10min，洗滌細(xì)胞兩次；末次離心后，棄上清，用5ml培養(yǎng)基充分混勻后置于T25培養(yǎng)瓶中，于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％CO₂、飽和濕度培養(yǎng)箱臥式培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶標(biāo)記日期；

換液：

定期觀察細(xì)胞生長情況，細(xì)胞培養(yǎng)三天后，將培養(yǎng)瓶取出，在100倍目鏡下觀測細(xì)胞貼壁良好，則可進(jìn)行換液，棄去其它類型雜細(xì)胞及未貼壁細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞生長情況，每3-4天全量換液1次；

傳代：

待細(xì)胞達(dá)到80％～90％融合時(shí)，進(jìn)行傳代，貼壁細(xì)胞用PBS洗滌2次，再用含有0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA的細(xì)胞消化液于37℃消化30秒到1分鐘，消化過程中，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞消化情況，待細(xì)胞大部分胞體回縮、變圓，即加入少量血清終止消化；然后加適量PBS緩沖液，用吸管反復(fù)吹打使細(xì)胞絕大部分脫落后，將細(xì)胞懸液移入15ml離心管，1000r/min，離心5min，棄去上清，后用培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，充分混勻后按1∶3比例傳代培養(yǎng)，記為P1代；傳代培養(yǎng)過程中每3-4天全量換液一次，貼壁細(xì)胞再次融合鋪滿瓶底后，重復(fù)上述操作，記為P2代，以此類推。

所述的ERCs及培養(yǎng)上清對(duì)同源及異源淋巴細(xì)胞還具有免疫調(diào)節(jié)作用。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于采用密度梯度離心法從經(jīng)血中成功分離出ERCs，并對(duì)其特異性表面標(biāo)記及增殖活力進(jìn)行了檢測，建立了該細(xì)胞穩(wěn)定的培養(yǎng)方法，由于其來源廣泛，取材方便，可以無創(chuàng)傷獲取，不涉及倫理問題，為MSCs的臨床應(yīng)用提供了新的替代來源，具有良好的應(yīng)用前景。