[發(fā)明專利]經(jīng)血源性間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及其免疫調(diào)節(jié)作用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010237174.1
• 申請日: 2010-07-27
• 公開（公告）號: CN101914494A
• 公開（公告）日: 2010-12-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 關(guān)方霞;周長輝;楊波;周云帆;田毅;谷晨熙;戴建武
• 申請（專利權(quán)）人: 鄭州大學(xué)
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N5/0781;C12N5/0783
• 代理公司: 鄭州異開專利事務(wù)所(普通合伙) 41114
• 代理人: 王霞

1.一種經(jīng)血源性間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)，其特征在于：它包括下述步驟：

第一步：培養(yǎng)基的配制

每390ml?DMEM高糖培養(yǎng)基加入100ml滅活后的胎牛血清、5ml?10000U/ml的青/鏈霉素及5ml?0.25mg/ml的兩性霉素B，得到體積為500ml的培養(yǎng)基備用；

第二步：經(jīng)血源性間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

材料獲取：

取月經(jīng)血5ml，加入0.2ml?0.25mg/ml的兩性霉素B、0.2ml青/鏈霉素，0.1mlEDTA-Na2防止病原微生物污染，在材料獲取24-48h內(nèi)進(jìn)行下述細(xì)胞分離；

細(xì)胞分離：

在15ml離心管中緩慢加入5ml比重為1.077的淋巴細(xì)胞分離液，將經(jīng)血與等量PBS緩沖液充分混勻后，用滴管沿管壁緩慢疊加于淋巴細(xì)胞分離液分層液面上，細(xì)胞懸液與分離液兩者比例為1∶1或2∶1；2000rpm/min水平離心20min；離心后管內(nèi)液體分為四層，上層為血漿和PBS緩沖液，下層主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞，中層為淋巴細(xì)胞分離液，在上、中層交界處有單核細(xì)胞層；用移液器吸取單核細(xì)胞層置入另一15ml離心管中，加入5倍以上體積的PBS緩沖液，1200rpm/min離心10min，洗滌兩次；末次離心后，棄上清，用5ml培養(yǎng)基充分混勻后置于T25培養(yǎng)瓶中，于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％CO₂、飽和濕度培養(yǎng)箱臥式培養(yǎng)；

換液：

細(xì)胞培養(yǎng)三天后，將培養(yǎng)瓶取出，棄去其它類型雜細(xì)胞及未貼壁細(xì)胞，每3-4天全量換液1次；

傳代：

待細(xì)胞達(dá)到80％～90％融合時，進(jìn)行傳代，貼壁細(xì)胞用PBS洗滌2次，再用含有0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA的細(xì)胞消化液于37℃消化30秒到1分鐘，消化過程中，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞消化情況，待細(xì)胞大部分胞體回縮、變圓，即加入少量血清終止消化；然后加適量PBS緩沖液，用吸管反復(fù)吹打使細(xì)胞絕大部分脫落后，將細(xì)胞懸液移入15ml離心管，1000r/min，離心5min，棄去上清，后用培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，充分混勻后按1∶3比例傳代培養(yǎng)，記為P1代；傳代培養(yǎng)過程中每3-4天全量換液一次，貼壁細(xì)胞再次融合鋪滿瓶底后，重復(fù)上述操作，記為P2代，以此類推。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)血源性間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，其特征在于：所述經(jīng)血源性間充質(zhì)干細(xì)胞及培養(yǎng)上清對同源及異源淋巴細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用。