[發明專利]群體感應信號分子抑制劑產生菌的鑒別方法及應用

有效

• 申請號: 201010236702.1
• 申請日: 2010-07-26
• 公開（公告）號: CN101914607A
• 公開（公告）日: 2010-12-15
• 發明（設計）人: 儲衛華
• 申請（專利權）人: 儲衛華;江蘇星海動物藥業科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;A23K1/16
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;劉成群

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種鑒別產生群體感應信號分子抑制劑的微生物的方法，本發明還涉及該方法在制備預防人和畜禽等動物疾病的益生素(微生態制劑)中的應用。

背景技術

群體感應(Quorum?Sensing，QS)是細菌根據自身細胞密度變化進行自我協調的一種群體行為。許多細菌能產生并釋放一種被稱為自誘導物(Auto?Inducer，AI)的信號分子，隨著細菌密度的增加，信號分子積累到一定濃度時則會與胞漿受體蛋白結合，調控細菌相關基因的表達，使細菌形成一種群體行為來有效地抵御環境壓力、攻擊宿主等。在一些致病菌(如銅綠假單胞菌、粘質沙雷氏菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、嗜水氣單胞菌等)中，群體感應系統調控相關致病因子的產生，如促進毒素、蛋白酶的產生、黏附、生物膜(Biofilm)的形成等。大量文獻表明缺失了群體感應系統的菌株其致病能力大大降低，因此細菌群體感應系統可作為抗感染藥物研發的新靶標。

益生素(Probiotic)又稱微生態制劑或活菌制劑，是一類活性微生物添加劑。一方面，益生素被動物采食后能在消化道特別是腸道內發育、繁殖并起有益作用，能促進動物生長發育，提高飼料利用率，降低幼畜幼禽死亡率，防止消化道疾病，提高機體免疫力；另一方面，相對使用抗生素引起的藥物殘留、耐藥菌株產生等問題，作為新型綠色添加劑的益生素，由于其無殘留、無污染以及不產生耐藥性等特點，有其獨特的優越之處，因而益生素已成為在畜禽飼料中很有前途的新型飼料添加劑。

通過篩選能產生群體感應抑制劑的微生物作為微生態制劑的出發菌是一個既發揮了群體感應信號分子抑制劑的作用，抑制病原菌產生群體感應信號分子，抑制其致病因子的產生，又能發揮微生態制劑特性的途徑，從而為人及動物疾病的預防提供更好的方法。

發明內容：

本發明的目的是針對上述技術問題提供一種鑒別產生群體感應分子抑制劑的微生物的方法。

本發明的另一個目的是提供采用上述方法得到的微生物所制備的微生物在制備預防人或動物疾病的益生素中的應用。

本發明的目的是通過下列技術措施實現的：

一種鑒別產生群體感應信號分子抑制劑的微生物的方法，包括下列步驟：

a、將含微生物的樣品用無菌生理鹽水稀釋，取100μl接種于10ml含有500μg/L群體感應信號分子(acyl-homoserine?lactone，AHLs，N-酰基高絲氨酸內酯)的KG液體培養基中，28-37℃，200rpm搖床培養24h，轉接到相同培養基中，連續3次后將獲得的增菌液稀釋涂布于LB瓊脂平板上，獲得單個菌落；

b、挑取獲得的單個菌落做一字型接種于LB瓊脂平板中央，28-37℃培養12-24h；

c、將5ml含有10⁶CFU/ml指示菌紫色色桿菌(Chromobacterium?violaceum)ATCC12472或者農桿菌(Agrobacterium?tumfaciens)KYC6的45-50℃保溫的0.5％LB瓊脂傾倒于步驟b所獲得的平板上，24-48h培養，在平板中央分離菌周圍未產生紫色或者藍色色素的，說明該菌能產生群體感應信號分子抑制劑。

所述的方法，其中步驟a所用KG液體培養基每升含有：氯化鈉1.0g，氯化鉀0.5g，氯化鎂0.4，氯化鈣0.1g，硫酸鈉0.15g，磷酸二氫鉀5.0g，2-(N-morpholino)ethanesulfonicacid(MES，2-嗎啉乙磺酸)1.0g，另含1mg氯化鐵，0.1g氯化錳，0.46g氯化鋅以及500μg?C_4-14-HSL，其余為水。

所述的方法，其中LB瓊脂平板是在LB液體培養基中加入1.5wt％的瓊脂，LB液體培養基每升含有：胰蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，氯化鈉10.0g，其余為水，pH為7.0-7.5。

采用上述鑒別方法得到的能產生群體感應信號分子抑制劑的微生物在制備預防人或動物疾病的益生素中的應用。

運用該方法制備益生素(微生態制劑)，能夠有效的抑制致病菌群體感應分子的活性，從而抑制致病菌的致病性。進一步，運用該技術制備益生素預防人及畜禽疾病。

本發明技術方案的分析，在第一步中，微生物產生群體感應信號分子(acyl-homoserine?lactone，AHLs，N-酰基高絲氨酸內酯)抑制劑能夠降解C_4-14-HSL(是群體感應信號分子中的一種)，從而利用C_4-14-HSL提供的C源、N源進行生長，而且不產生群體感應信號分子抑制劑的微生物則不能生長。