[發明專利]一種大腸桿菌多個腸毒素基因的融合體及其應用

有效

• 申請號: 201010236644.2
• 申請日: 2010-07-26
• 公開（公告）號: CN101914564A
• 公開（公告）日: 2010-12-15
• 發明（設計）人: 徐永平;尤建嵩;金禮吉;李曉宇;馬永生;王林會;李化強;吳菲菲
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C07K19/00;A61K48/00;A61K39/116;A61P31/04;A61P1/12;A61K39/108
• 代理公司: 大連理工大學專利中心 21200
• 代理人: 梅洪玉

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種基因工程亞單位疫苗，特別涉及一種產腸毒素大腸桿菌(ETEC)多價腸毒素免疫原，用于預防和治療由ETEC等細菌引起的腹瀉。

背景技術

產腸毒素大腸桿菌(ETEC)可引起幼齡動物(包括仔豬、犢牛、羔羊等)的急性、傳染性腹瀉，嚴重危害畜牧養殖業的健康發展，并且造成巨大的經濟損失。ETEC還是發展中國家嬰幼兒及旅游者腹瀉的主要病原體，全球每年因ETEC感染的腹瀉病例高達6.5億人次，導致約38萬5歲以下兒童死亡(Sizemore等，2004年，Expert?Rev.Vaccines)。

ETEC引起腹瀉發生的作用機理是：細菌首先借助其表面的菌毛等黏附素定植于小腸粘膜上皮細胞上，進而在腸道內大量繁殖并產生腸毒素，作為直接致病因子的腸毒素使腸上皮細胞代謝紊亂，分泌大量水分和電解質進入腸腔，最終導致腹瀉的發生。ETEC的菌毛種類繁多，動物來源菌株的菌毛，較重要的有F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)、F18、F41等；人源ETEC的菌毛更多，已鑒定的超過25種。但是ETEC分泌的腸毒素只有兩種，不耐熱腸毒素LT和耐熱腸毒素ST，ST分為STa和STb兩個亞型。

對于ETEC性腹瀉的治療，生產中主要應用抗生素及化學藥物。但控制此病的關鍵在于預防，預防的方法除了保持衛生、消毒環境外，主要使用疫苗免疫預防。目前商品化的ETEC疫苗有全菌滅活疫苗，菌毛亞單位疫苗和類毒素疫苗。以下列舉獲得我國農業部獸藥產品批準文號的4個疫苗，它們是在生產實踐中使用的獸用大腸桿菌疫苗的典型代表：

(1)羊大腸埃希氏菌病滅活疫苗，黑龍江省生物制品一廠，獸藥生字(2006)080074009。

(2)仔豬大腸桿菌三價滅活疫苗，齊魯動物保健品保健公司，獸藥生字(2006)150251028。

(3)仔豬大腸桿菌病K88/K99雙價基因工程滅活疫苗，上海海利生物藥品有限公司，獸藥生字(2007)090201027。

(4)仔豬大腸桿菌病K88、LTB雙價基因工程活疫苗，中牧實業股份有限公司江西生物藥廠，獸藥生字(2008)140401025。

不耐熱腸毒素LT由兩個亞基組成，A亞基(LTA)是毒性中心，B亞基(LTB)是一個五聚體結構，沒有毒性且有良好的免疫原性，常常被用作疫苗的成分。耐熱腸毒素STa和STb是分子量很小的半抗原，缺乏免疫原性，若直接用全菌滅活疫苗免疫無法誘導機體產生針對STa和STb的中和抗體。為了解決這一問題，可以將耐熱腸毒素STa或STb偶聯到大分子的載體蛋白上，使它們具備免疫原性(I.Klipstein等Development?of?a?vaccine?of?cross-linked?heat-stable?andheat-labile?enterotoxins?that?protects?against?Escherichia?coli?producing?eitherenterotoxin.Infect.Immun.1982，37(2)：550-557.II.Dubreuil等A?recombinantEscherichia?coli?heat-stable?enterotoxin?b(STb)fusion?protein?eliciting?neutralizingantibodies，FEMS?Immunol.Med.Microbiol.1996，13：317-323.)。

雖然ST是導致腹瀉發生的重要致病因子，但由于天然STa和STb分子沒有免疫原性，現在上市的疫苗產品都不含有ST成分。在已知的現有技術中，為了制備有效的STa或STb類毒素，研究人員還構建了下列融合亞單位疫苗：

①LTB-STa二價融合腸毒素(張兆山等，不耐熱腸毒素和耐熱腸毒素基因的融合.中華微生物學和免疫學雜志，1994，14(04)：219-222.)

②STa-LTB二價融合腸毒素(許崇波等，大腸桿菌腸毒素ST1-LT-B融合基因的構建.中國獸醫學報，1998，18(05)：463-465.)

③K88ac-ST1-LTB三價融合腸毒素及菌毛蛋白(許崇波等，表達大腸桿菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白工程菌株的免疫原性研究.中國預防獸醫學報，2003，25(01)：9-12.)

④LTB-STa-STb三價融合腸毒素(葛艷等，產腸毒素大腸桿菌腸毒素LTB、ST?I和ST?II融合基因的構建與表達研究.中國預防獸醫學報，2002，24(05)：27-29.)