[發明專利]海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達的制備方法

無效

• 申請號: 201010236503.0
• 申請日: 2010-07-16
• 公開（公告）號: CN101974541A
• 公開（公告）日: 2011-02-16
• 發明（設計）人: 劉靜雯;鄭天凌;張雅蘭;董雙林
• 申請（專利權）人: 集美大學
• 主分類號: C12N15/34
• 分類號: C12N15/34;C12N15/70;C07K14/01
• 代理公司: 廈門市新華專利商標代理有限公司 35203
• 代理人: 朱凌

技術領域

本發明涉及一種海洋球石藻(Emiliania?huxleyi)病毒外殼重組蛋白原核表達的制備方法。?

背景技術

目前就藻類病毒在全球氣候變化、生物地化循環和有害赤潮生消過程中的生態學作用和意義受到極大關注。在自然海域中，病毒感染是導致浮游植物裂解和自然死亡的主要因素之一。高達0.3％/d的浮游植物死亡率情況不僅出現在藻類赤潮暴發后的消亡階段。由于缺乏用于病毒誘導的宿主死亡率測定的可靠方法，有關自然海域中病毒對微藻裂解率的報道很少，尤其是對由于病毒裂解導致的浮游植物原位損失率知之甚少。?

目前用于估計病毒介導的浮游植物死亡率的方法主要有：①用透射電鏡觀察被感染的細胞，以被感染細胞出現的頻率為基礎評估病毒介導的死亡率；②是通過病毒總量和每個細胞釋放的病毒粒子數來計算細胞的裂解率，使用這種方法估計微藻死亡率的前提是假設病毒粒子的釋放量是已知的，而且可以將我們感興趣的病毒與樣品中其它病毒區分開來；③通過病毒產量估計病毒誘導的宿主死亡率。采用稀釋技術推算病毒的產量，但稀釋前的濃縮步驟比較復雜，很難在不影響藻類細胞生理狀態的情況下濃縮出相對易碎的藻類細胞，因此這種技?術遲遲未被用于浮游植物上。目前就病毒對微藻的感染率及導致宿主裂解率的各種估計方法都存在不同程度的缺陷，相比而言，采用電鏡技術以被感染細胞出現的頻率為基礎評估病毒介導的死亡率，這種方法最直接、準確而且不需要對樣品進行培養，但電鏡的制樣和觀察過程仍比較煩瑣，成本也高。?

在自然水體中，浮游植物病毒種類復雜多樣，病毒的感染活性、裂解周期、病毒粒子的釋放量等方面都相差極大，加之高度種內特異性和宿主對抗病毒感染的寄生抗性使得對藻病毒的生態學研究顯得更加復雜。因此，采用一種通用的檢測方法實現對自然水體中病毒介導的總的浮游植物死亡率的估計是不可能的。目前，我們面臨的挑戰是如何結合現有方法并發展更精確、方便可行的方法和技術，就某種感興趣的病毒與宿主藻系統，建立室內培養條件下病毒對宿主感染和裂解率的精確檢測和估計方法，并延伸到自然海域中進行校正和改進。病毒感染微藻通常是宿主特異性的，有時甚至只專一地感染一個宿主株系，而病毒的感染特性往往取決于病毒顆粒外殼蛋白的結構.因此，從病毒外殼蛋白著手有望尋找出病毒感染檢測的新方法。?

海洋球石藻是海洋中碳循環的重要部分，它們吸收海水中的碳，并將其轉變為類似于堅硬的輪轂罩的盤狀物，最終沉積海底。該藻在全球廣泛分布，每年都會發生無數次水華，由于球石藻外覆由特殊成分構成的球石粒，因此它的水華能夠對周圍環境產生諸多重要影響；其次，由于球石粒的主要成分是碳酸鈣，在它的產生過程中伴隨著二氧化碳的生成，同時球石藻還是高產DMSP生產者中最為重要的種類。在發生大面積的球石藻赤潮時，病毒的裂解促使藻細胞產生的DMSP及釋放到外界的DMS對于局部甚至整個海域環境都會產生很大影響。可見，球石藻類在全球碳循環中起著重要作用。球石藻中以E.?huxleyi最為重要，目前已分離到十多株海洋球石藻病毒(EhVs)，均屬于藻類雙鏈DNA病毒，也是迄今發現的最大的病毒，其基因組大小在560kb左右，且為裂解性病毒。?

發明內容

為了解決上述問題，本發明的目的在于提供了一種海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達的制備方法，本發明的方法能快速、準確檢測球石藻病毒感染導致的宿主細胞裂解率。?

為達到上述的目的，本發明采用如下技術方案：?

一種海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達的制備方法，包括如下步驟：?

a)海洋球石藻病毒EhV(分離于挪威海域，由挪威卑爾根大學生物系微生物研究所贈送)與宿主之間穩定感染體系的建立，病毒感染90小時后取病毒裂解上清液進行病毒的純化與濃縮；?

b)根據海洋球石藻病毒EhV外殼蛋白基因的全長序列設計引物；?

c)從步驟a)中已提純的海洋球石藻病毒EhV中提取DNA；?

d)PCR擴增海洋球石藻病毒EhV外殼蛋白基因；?

e)PCR電泳回收產物，連接質粒，轉化大腸桿菌感受態細胞，挑取克隆，提取質粒采用EcoR?I和Not?I進行雙酶切后電泳分析PCR產物并進行測序鑒定，海洋球石藻病毒EhV外殼蛋白基因測序結果見序列表1。?

f)選擇與預期大小相符的條帶進行回收，通過雙酶切得到目的基因片斷，連接質粒，轉化大腸桿菌感受態細胞，篩選得到重組載體；?

g)將構建好的重組載體轉化入大腸桿菌表達菌株內，挑取單克?隆進行目的基因的小量表達；?

h)挑取單克隆進行目的基因的大量表達；?