[發明專利]海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達的制備方法

無效

• 申請號: 201010236503.0
• 申請日: 2010-07-16
• 公開（公告）號: CN101974541A
• 公開（公告）日: 2011-02-16
• 發明（設計）人: 劉靜雯;鄭天凌;張雅蘭;董雙林
• 申請（專利權）人: 集美大學
• 主分類號: C12N15/34
• 分類號: C12N15/34;C12N15/70;C07K14/01
• 代理公司: 廈門市新華專利商標代理有限公司 35203
• 代理人: 朱凌

1.一種海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

a)海洋球石藻病毒EhV與宿主之間穩定感染體系的建立，病毒感染90小時后取病毒裂解上清液進行病毒的純化與濃縮；

b)根據海洋球石藻病毒EhV外殼蛋白基因的全長序列設計引物；

c)從步驟a)中已提純的海洋球石藻病毒EhV中提取DNA；

d)PCR擴增海洋球石藻病毒EhV外殼蛋白基因；

e)PCR電泳回收產物轉化大腸桿菌感受態細胞，挑取克隆，提取質粒采用EcoR?I和Not?I進行雙酶切后電泳分析PCR產物并進行測序鑒定，海洋球石藻病毒外殼重組蛋白基因測序結果見序列表1。

f)選擇與預期大小相符的條帶進行回收，通過雙酶切得到目的基因片斷，連接質粒，轉化大腸桿菌感受態細胞，篩選得到重組載體；

g)將構建好的重組載體轉化入大腸桿菌表達菌株內，挑取單克隆進行目的基因的小量表達；

h)挑取單克隆進行目的基因的大量表達；

i)將誘導前的樣品、誘導后及純化后的樣品進行SDS-PAGE鑒定蛋白表達量。

2.如權利要求1所述的海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達的制備方法，其特征在于：所述的純化過程中采用SM緩沖液，其配方為：10mmol/L?NaCl，50mmol/L?Tris，10mmol/L?MgSO₄和口0.1％?gelatin，pH?7.5。

3.如權利要求1所述的海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達的制備方法，其特征在于所述引物采用SEQIDNO.1和SEQIDNO.2；其核苷酸序列分別為：

SEQIDNO.1：MCP-F：5′-GACGAATTCCTCTGGATTTGGTGGTGG-3′(劃線部分為EcoRI酶切位點)；

SEQIDNO.2：MCP-R：5′-ACCGCGGCCGCTCAGTTCGAGTATAATA-3′(劃線部分為Not?I酶切位點)。

4.如權利要求1所述的海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達的制備方法，其特征在于：所述PCR的反應條件為：94℃預變性1分鐘后進行94℃變性15秒、55℃復性30秒、68℃延伸2分鐘的30個循環的擴增，保存于4℃。

5.如權利要求1所述的海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達的制備方法，其特征在于：所述步驟e)、f)中大腸桿菌采用DH5α；所述步驟g)中大腸桿菌采用BL21(DE3)。

6.如權利要求1所述的海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達的制備方法，其特征在于：所述的雙酶切采用的酶為EcoRI和NotI。

7.如權利要求1所述的海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達的制備方法，其特征在于：所述步驟e)中的質粒采用pMD19-T作為載體。

8.如權利要求1所述的海洋球石藻病毒外殼重組蛋白原核表達的制備方法，其特征在于：所述步驟f)中采用pGEX-4T-3作為表達載體，所述的重組載體為pGEX-4T-3-EhV?MCP，含有權利要求1所述的海洋球石藻病毒外殼重組蛋白基因的DNA序列。