[發(fā)明專利]超高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用篩選組織蛋白酶B抑制劑的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010235281.0
• 申請日: 2010-07-26
• 公開（公告）號: CN101907614A
• 公開（公告）日: 2010-12-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉淑瑩;?？?/a>;劉志強(qiáng);宋鳳瑞
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所
• 主分類號: G01N30/72
• 分類號: G01N30/72;C12Q1/37
• 代理公司: 長春科宇專利代理有限責(zé)任公司 22001
• 代理人: 馬守忠

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，涉及超高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用篩選組織蛋白酶B抑制劑的方法，具體而言，涉及天然產(chǎn)物提取物或單體對組織蛋白酶B體外抑制率以及組織蛋白酶催化活性的超高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用的方法。

技術(shù)背景

組織蛋白酶B是溶酶體內(nèi)半胱氨酸蛋白水解酶，屬于木瓜蛋白酶家族，在pH值3.0～7.0都具有催化活性，其特異性底物為Z-Arg-Arg-7-氨基-4-甲基香豆素，組織蛋白酶B催化底物肽鍵斷裂生成7-氨基-4-甲基香豆素。近年來研究表明組織蛋白酶B在腫瘤的發(fā)展中起作用的一類關(guān)鍵酶，組織蛋白酶B通過多種機(jī)制促進(jìn)血管形成，從而促進(jìn)腫瘤生長，同時降解基底膜主要成分以及激活膠原酶、尿激酶等其他蛋白酶發(fā)生協(xié)同作用使腫瘤易侵襲、轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散，在腫瘤組織中還發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶B與組織蛋白酶B抑制劑平衡作用也參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。在多種人類腫瘤中都已經(jīng)發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶B表達(dá)水平上調(diào)。組織蛋白酶B已成為腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要靶點，有關(guān)其抑制劑的研究可能為腫瘤的治療提供新的手段。

組織蛋白酶B抑制劑的篩選一般使用光譜法，其不足之處在于光譜法易受到背景干擾，可能得到假陽性或假陰性結(jié)果(Arjen?R.de?Boer，Henk?Lingeman，Wilfried?M.A.Niessen，Hubertus?Irth.Trends?in?Analytical?Chemistry，Vol.26，No.9，2007.)。質(zhì)譜方法最大的優(yōu)勢在于它的檢測本質(zhì)是基于一個分子的質(zhì)荷比?，F(xiàn)代質(zhì)譜儀的高精確度和靈敏度為我們提供了不受干擾的分子指紋圖譜，串聯(lián)質(zhì)譜高度特異性和精確性揭示待分析化合物的結(jié)構(gòu)信息，且質(zhì)譜方法可以同時檢測和定量多種組分(Gejing?Deng，Gautam?Sanyal.Journal?of?Pharmaceutical?and?Biomedical?Analysis?40(2006)528-538)。酶促反應(yīng)緩沖液中往往含有不揮發(fā)的鹽和為保持酶活性穩(wěn)定的添加物，鹽和添加物可能會污染質(zhì)譜儀的離子源并導(dǎo)致離子化抑制，樣品進(jìn)入質(zhì)譜前使用高效液相進(jìn)行分離可以避免反應(yīng)體系中的鹽和添加物對檢測的影響(Arjen?R.de?Boer，Thomas?Letzel，Danny?A.van?Elswijk，Henk?Lingeman，Wilfried?M.A.Niessen，and?Hubertus?Irth.Anal.Chem.2004，76，3155-3161)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供超高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用篩選組織蛋白酶B抑制劑的方法。本發(fā)明可用于分析天然產(chǎn)物提取物或單體對組織蛋白酶B體外抑制率以及組織蛋白酶催化活性的超高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用的方法。

本發(fā)明所述的天然產(chǎn)物提取物或單體對組織蛋白酶B的體外抑制是指天然產(chǎn)物提取物或單體抑制組織蛋白酶B的活性從而導(dǎo)致酶促反應(yīng)產(chǎn)物7-氨基-4-甲基香豆素的量減少；

本發(fā)明所述的組織蛋白酶催化活性是指在37℃，組織蛋白酶催化底物生成7-氨基-4-甲基香豆素的量。

本發(fā)明包括以下內(nèi)容：以Z-Arg-Arg-7-氨基-4-甲基香豆素為底物，組織蛋白酶B在37℃催化底物生成7-氨基-4-甲基香豆素，用超高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用對7-氨基-4-甲基香豆素進(jìn)行定量。

本發(fā)明提供的超高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用篩選組織蛋白酶B抑制劑的方法，所述的組織蛋白酶B抑制劑是天然產(chǎn)物提取物或單體，其包括以下步驟：

(1)酶促反應(yīng)緩沖液的配制

緩沖液包括0.4摩爾/升醋酸鈉，4毫摩爾/升乙二胺四乙酸，8毫摩爾/升二硫蘇糖醇，用醋酸調(diào)pH值為5.5；

(2)標(biāo)準(zhǔn)品的配制

用甲醇將標(biāo)準(zhǔn)品分別配成濃度為100納摩爾/升、200納摩爾/升、500納摩爾/升、1微摩爾/升、2微摩爾/升、5微摩爾/升、10微摩爾/升、20微摩爾/升的標(biāo)準(zhǔn)溶液，且每個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液均含1微摩爾/升的7-氨基-4-甲氧基甲基香豆素作為內(nèi)標(biāo)；所述的標(biāo)準(zhǔn)品為7-氨基-4-甲基香豆素；

(3)對照品和樣品的酶促反應(yīng)

對照品：反應(yīng)總體積100微升，終濃度8納摩爾/升的組織蛋白酶B，在37℃孵育30分鐘，加入終濃度20微摩爾/升的底物Z-Arg-Arg-7-氨基-4-甲基香豆素，37℃反應(yīng)20分鐘后，加入1％(v/v)三氟乙酸終止反應(yīng)，同時加入終濃度為1微摩爾/升的內(nèi)標(biāo)7-氨基-4-甲氧基甲基香豆素，作為對照品；供超高效液相色譜/質(zhì)譜測定；