[發(fā)明專利]超高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用篩選組織蛋白酶B抑制劑的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010235281.0
• 申請日: 2010-07-26
• 公開（公告）號: CN101907614A
• 公開（公告）日: 2010-12-08
• 發(fā)明（設計）人: 劉淑瑩;牛俊;劉志強;宋鳳瑞
• 申請（專利權）人: 中國科學院長春應用化學研究所
• 主分類號: G01N30/72
• 分類號: G01N30/72;C12Q1/37
• 代理公司: 長春科宇專利代理有限責任公司 22001
• 代理人: 馬守忠

1.一種超高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用篩選組織蛋白酶B抑制劑的方法，所述的組織蛋白酶B抑制劑是天然產(chǎn)物提取物或單體，其特征在于，包括以下步驟：

(1)酶促反應緩沖液的配制

緩沖液包括0.4摩爾/升醋酸鈉，4毫摩爾/升乙二胺四乙酸，8毫摩爾/升二硫蘇糖醇，用醋酸調(diào)pH值為5.5；

(2)標準品的配制

用甲醇將標準品分別配成濃度為100納摩爾/升、200納摩爾/升、500納摩爾/升、1微摩爾/升、2微摩爾/升、5微摩爾/升、10微摩爾/升、20微摩爾/升的標準溶液，且每個濃度的標準品溶液均含1微摩爾/升的7-氨基-4-甲氧基甲基香豆素作為內(nèi)標；所述的標準品為7-氨基-4-甲基香豆素；

(3)對照品和樣品的酶促反應

對照品：反應總體積100微升，終濃度8納摩爾/升的組織蛋白酶B，在37℃孵育30分鐘，加入終濃度20微摩爾/升的底物Z-Arg-Arg-7-氨基-4-甲基香豆素，37℃反應20分鐘后，加入1％(v/v)三氟乙酸終止反應，同時加入終濃度為1微摩爾/升的內(nèi)標7-氨基-4-甲氧基甲基香豆素，作為對照品；供超高效液相色譜/質(zhì)譜測定；

樣品：反應總體積100微升，終濃度8納摩爾/升的組織蛋白酶B與終濃度為2微摩爾/升的組織蛋白酶B抑制劑于37℃孵育30分鐘，加入終濃度20微摩爾/升的底物Z-Arg-Arg-7-氨基-4-甲基香豆素，37℃反應20分鐘后，加入1％(v/v)三氟乙酸終止反應，同時加入終濃度為1微摩爾/升的內(nèi)標7-氨基-4-甲氧基甲基香豆素，作為樣品；供超高效液相色譜/質(zhì)譜測定；

(4)標準品、對照品和樣品的檢測

對標準品檢測：采用7-氨基-4-甲氧基甲基香豆素為內(nèi)標，以內(nèi)標法定量，對步驟(2)的系列標準品溶液進行超高效液相色譜和質(zhì)譜檢測，從總離子流圖中提取7-氨基-4-甲基香豆素m/z＝176.0712及7-氨基-4-甲氧基甲基香豆素m/z＝206.0817的色譜圖，分別積分求峰面積，以所述的標準品濃度為橫坐標，以7-氨基-4-甲基香豆素與7-氨基-4-甲氧基香豆素峰面積比值為縱坐標，在所述的標準品濃度為100納摩爾/升至20微摩爾/升范圍內(nèi)，用微軟公司(Microsoft)的Excel軟件得到7-氨基-4甲基香豆素的線性方程：

y＝ax+b

式中，y為所述的標準品7-氨基-4-甲基香豆素與內(nèi)標7-氨基-4-甲氧基香豆素峰面積比值；x為標準品的濃度，量綱為微摩爾/升；a、b為軟件計算得到的常數(shù)；同時該軟件計算得到相關系數(shù)R²；

①超高效液相色譜的檢測條件

超高效液相色譜儀：安捷倫RRLC1200SL；

色譜柱：安捷倫ZORBAX?Extend-C18(2.1*50毫米，1.8微米)；

流動相：甲醇(A)和水(B)；

梯度洗脫程序：0～8分鐘，30％A～55％A；8～8.1分鐘，55％A～30％A；8.1～13分鐘，30％A；

流速：0.7毫升/分鐘；

進樣量：10微升；

②質(zhì)譜條件

質(zhì)譜儀：安捷倫6520；

離子源：大氣壓化學電離源(APCI)正離子模式；

毛細管電壓：3500伏特；

氣體溫度：350攝氏度；

霧化器溫度：350攝氏度；

干燥氣流速：5升/分鐘；

霧化氣氣壓：275.8千帕；

碎裂電壓：175伏特；

錐孔電壓：65伏特；

對照品和樣品檢測均按上述的超高效液相色譜和質(zhì)譜條件分別進行檢測；

(5)抑制劑對組織蛋白酶的抑制率

分別根據(jù)對對照品和樣品測得的峰面積比值在線性方程中求得對照品和樣品中7-氨基-4-甲基香豆素濃度，抑制劑對組織蛋白酶的抑制率按照以下公式計算：

I_樣品＝(C_對照-C_樣品)/C_對照×100％

式中，I為抑制劑對組織蛋白酶的抑制率，C_對照為根據(jù)線性方程求得的對照品中7-氨基-4-甲基香豆素濃度，量綱為微摩爾/升、C_樣品為根據(jù)線性方程求得的樣品中7-氨基-4-甲基香豆素濃度，量綱為微摩爾/升。