[發明專利]一種脂籠蛋白的高效表達、復性、純化方法

無效

• 申請號: 201010234695.1
• 申請日: 2010-07-23
• 公開（公告）號: CN102336820A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發明（設計）人: 林勝祥;陳澤庸;鄒永水
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海生命科學研究院
• 主分類號: C07K14/00
• 分類號: C07K14/00;C07K1/14;C12N15/11;C12N15/70
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

技術領域

本發明屬于生物技術領域；更具體地，本發明涉及一種脂籠蛋白的高效表達、復性、純化方法。

背景技術

脂籠蛋白(lipocalin)家族是由小的分泌型蛋白組成，其成員遍布脊椎動物、無脊椎動物、植物和細菌中，大小一般是120-180個氨基酸。在一級序列上，脂籠蛋白都含有短的保守域[Flower?DR，North?AC，Attwood?TK.Structure?and?sequence?relationships?in?the?lipocalins?and?related?proteins.Protein?Sci.1993May；2(5)：753-61；Flower?DR，North?AC，Attwood?TK.Mouse?oncogene?protein?24p3?is?a?member?of?the?lipocalin?protein?family.Biochem?Biophys?Res?Commun.1991?Oct?15；180(1)：69-74]，它們的三級結構中通常含6-或者8-鏈的β折疊形成一個桶狀結構[George?Kontopidis，Carl?Holt?and?Lindsay?Sawyer.The?Ligand-binding?Site?of?Bovine?β-Lactoglobulin：Evidence?for?a?Function？Journal?of?Molecular?Biology.Volume?318，Issue?4，10May?2002，Pages?1043-1055]。

過去，這個家族的蛋白主要被歸為一類轉運蛋白，但現在發現它們還具有一些其他的重要功能，主要有：配體轉運，視覺，嗅覺，限制性內切酶活性，細胞穩態調節，免疫反應等等[Pugalenthi?G，Kandaswamy?KK，Suganthan?PN，Archunan?G，Sowdhamini?R.Identification?of?functionally?diverse?lipocalin?proteins?from?sequence?information?using?support?vector?machine.Amino?Acids.2010?Feb?26；Flower?DR.The?lipocalin?protein?family：structure?and?function.Biochem?J.1996?Aug?15；318(Pt?1)：1-14]。

脂籠蛋白能夠在大腸桿菌中高水平表達，但是以包涵體的形式存在，為了研究rLcn?8的結構與功能，需要分離包涵體進行變性與復性、純化后進行晶體生長以及熒光光譜分析。然而，如何對包涵體進行變性和復性，并且在復性后獲得生物活性良好的蛋白，對于本領域人員而言較難。因此，需要對此進行深入研究，從而建立一種有效的獲得生物活性良好的可溶性蛋白的方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種脂籠蛋白的高效表達、復性、純化方法。

在本發明的第一方面，提供一種制備可溶性脂籠蛋白的方法，所述方法包括：

(1)將脂籠蛋白的包涵體進行變性，分離含有經變性的脂籠蛋白的上清；

(2)調節所獲得的上清的PH值至5-6，用聚合度為200-1000的PEG和C2-C8(如C3、C4、C5、C6、C7)的多羥基醇進行復性，獲得可溶性脂籠蛋白。

在另一優選例中，采用鹽酸調節PH值至5-6。

在一個優選例中，所述的包涵體如下表達：

(a)將含有脂籠蛋白編碼基因的表達載體轉化大腸桿菌，培養該大腸桿菌；

(b)用IPTG誘導大腸桿菌，使之表達脂籠蛋白的包涵體。

在另一優選例中，IPTG的濃度是1±0.2mmol/L。

在另一優選例中，所述的方法還包括：破碎大腸桿菌細胞，分離獲取沉淀，其中含有脂籠蛋白的包涵體。

在另一優選例中，采用Tirs-HCl、NaCl和甘油破碎。

在另一優選例中，采用50±10mmol/L?Tris-HCl(pH?8.0)、100±20mmol/LNaCl、5±1％(v/v)甘油破碎。

在另一優選例中，所述的方法，還包括：對獲得的沉淀進行洗滌，去除部分雜質。

在另一優選例中，，所述的洗滌包括步驟：用尿素懸浮沉淀，勻漿，超聲波粉碎后離心棄上清。

在另一優選例中，所述步驟重復2-3次。

在另一優選例中，所述的尿素濃度為1±0.2mol/L。