[發(fā)明專利]人源S100A4蛋白的基因優(yōu)化與高效表達(dá)

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010234584.0
• 申請日: 2010-07-23
• 公開（公告）號: CN102337269A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王天輝;陳昀贇;劉子泉;徐傳香;王德剛;崔博;佘曉俊;陳學(xué)偉;張娜;安改紅;劉洪濤
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/70;C07K14/47
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及人源S100A4基因優(yōu)化與高效表達(dá)方法。

背景技術(shù)

S100A4蛋白是以非共價(jià)鍵結(jié)合二聚體存在于細(xì)胞內(nèi)，而以共價(jià)結(jié)合二聚體分泌到細(xì)胞外。推測Ca²⁺結(jié)合后可導(dǎo)致S100A4蛋白構(gòu)型改變，在表面暴露出新的結(jié)合位點(diǎn)，從而可與一系列靶標(biāo)結(jié)合。胞外基質(zhì)中的S100A4蛋白是一種單體和二聚體共存的狀態(tài)，其比例受Ca²⁺結(jié)合程度的影響；胞內(nèi)S100A4蛋白的同源二聚體和異源二聚體形式也是同時(shí)存在。因此，從S100A4蛋白可形成同源二聚體、異源二聚體、寡聚體的多種形式來看，其結(jié)構(gòu)具有很強(qiáng)的可變性，這可能也是它在體內(nèi)具有多種生物學(xué)功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

本研究采用全基因合成法合成S100A4基因。并根據(jù)大腸桿菌偏好密碼子，利用Condonopt密碼子優(yōu)化軟件優(yōu)化從GenBank中檢索到的S100A4基因序列，全部選用偏好密碼子，設(shè)計(jì)合成S100A4序列的引物。為了便于蛋白表達(dá)，在兩端引物分別引入Nde?I和Xho?I的酶切位點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種制備并優(yōu)化人源S100A4基因的方法。

本發(fā)明優(yōu)化后的S100A4序列與原序列相比，34個(gè)堿基被替換，序列中所有的E.coli低頻密碼子均被高頻密碼子所替換。

本發(fā)明還公開了上述人源S100A4蛋白分子的基因制備方法。該方法包括如下步驟：

(1)S100A4序列的優(yōu)化設(shè)計(jì)與引物合成：

(2)PCR合成優(yōu)化后S100A4序列并與表達(dá)載體pET32a連接，構(gòu)建pET32a-S100A4表達(dá)載體；

(3)在大腸桿菌E.coli?BL21(DE3)中進(jìn)行高效表達(dá)；

制備人源S100A4蛋白編碼基因可以按照實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行，優(yōu)選PCR法。優(yōu)選PCR重疊引物延伸法(黃培堂等譯，J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版，p1091-1113)。所述表達(dá)載體可以是常規(guī)的原核系統(tǒng)表達(dá)載體，如商業(yè)PET系列載體和國內(nèi)廣泛使用的pET32a載體，優(yōu)選PET32a載體。大腸桿菌可以是適合原核系統(tǒng)表達(dá)的配套大腸桿菌，當(dāng)使用PET類載體時(shí)，宿主菌優(yōu)選大腸桿菌E.coli?BL21(DE3)系列；當(dāng)使用PBV220載體時(shí)宿主菌可選擇多種商業(yè)上提供的大腸桿菌，優(yōu)選大腸桿菌E.coli?DH5α。

本發(fā)明根據(jù)大腸桿菌偏好密碼子設(shè)計(jì)并合成S100A4序列的引物，PCR擴(kuò)增優(yōu)化后的S100A4序列克隆至表達(dá)載體pET32a上，經(jīng)測序完全正確，再將其轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)。在IPTG誘導(dǎo)下，在大腸桿菌E.coli?BL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。

附圖說明

圖1為人源S100A4序列中被替換的堿基示意圖

圖2為合成人源S100A4基因的PCR產(chǎn)物1.5％瓊脂糖凝膠電泳。

圖3為菌落PCR法鑒定陽性pET32a-S100A4克隆

圖4為表達(dá)載體pET32a-S100A4的酶切鑒定

圖5為測序結(jié)果與優(yōu)化后的人源S100A4序列的比較

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明：

1.材料與方法

1.1材料

1.1.?1質(zhì)粒與菌株

表達(dá)載體pET32a、大腸桿菌E.coli?BL21(DE3)由本實(shí)驗(yàn)保存。

1.1.2酶及主要試劑

膠同收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自美國OMEGA公司；Nde?I、Xho?I、Taq?DNA聚合酶及T4DNA?Ligase均購自Takara公司；Pfu?DNA聚合酶、DL2000核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物購自北京TIANGEN公司，低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)物購自TaKaRa公司。

1.?2方法

1.2.1人源S100A4序列的優(yōu)化設(shè)計(jì)與引物合成

①根據(jù)大腸桿菌偏好密碼子，利用Condonopt密碼子優(yōu)化軟件優(yōu)化從GenBank中檢索到的人源S100A4基因序列；

②全部選用偏好密碼子，設(shè)計(jì)合成人源S100A4序列的引物(表1)。

③為了便于蛋白表達(dá)，在兩端引物分別引入了Nde?I和Xho?I的酶切位點(diǎn)。

表1?人源S100A4的全合成引物

Table?1.oligonucleotide?primers?with?mutual?overlaps

1.2.2PCR合成優(yōu)化后S100A4序列