[發(fā)明專利]人源S100A4蛋白的基因優(yōu)化與高效表達(dá)

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010234584.0
• 申請(qǐng)日: 2010-07-23
• 公開（公告）號(hào): CN102337269A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王天輝;陳昀贇;劉子泉;徐傳香;王德剛;崔博;佘曉俊;陳學(xué)偉;張娜;安改紅;劉洪濤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/12
• 分類號(hào): C12N15/12;C12N15/70;C07K14/47
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.權(quán)利要求1所述的人源S100A4蛋白的基因優(yōu)化與高效表達(dá)，其特征在于包括如下步驟：

(1)人源S100A4序列的優(yōu)化設(shè)計(jì)與引物合成：

①根據(jù)大腸桿菌偏好密碼子，利用Condonopt密碼子優(yōu)化軟件優(yōu)化從GenBank中檢索到的S100A4基因序列；

②全部選用偏好密碼子，設(shè)計(jì)合成S100A4序列的引物。

③為了便于蛋白表達(dá)，在兩端引物分別引入了Nde?I和Xho?I的酶切位點(diǎn)。

(2)PCR合成優(yōu)化后S100A4序列

PCR法合成。

(3)表達(dá)載體pET32a-S100A4的構(gòu)建

①以人源S100A4基因全長片段為模板，以pfu酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增引入酶切位點(diǎn)。

②用Nde?I、Xho?I雙酶切S100A4純化后的PCR產(chǎn)物，所得產(chǎn)物與pET32a質(zhì)粒連接并轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主大腸桿菌E.coli?BL21(DE3)中，PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子。

(4)在大腸桿菌E.coli?BL21(DE3)中進(jìn)行高效表達(dá)

①將陽性單克隆菌，接種于5mL含氨芐西林的LB培養(yǎng)基中，37℃，160r/m過夜培養(yǎng)。

②次日將過夜培養(yǎng)的菌液按1∶50的比例重新轉(zhuǎn)接400mL的LB(含Amp)培養(yǎng)基中。30℃條件下，160rpm振蕩培養(yǎng)3h后，加入1mol/L的IPTG溶液1.2ml，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4-5h后，以8000rpm收集菌體，用PH為7.4，0.2mol/L?PB溶液重懸菌體后加入一定量的EDTA溶液，進(jìn)行超聲破碎菌體。超聲破碎條件：功率200W，超聲處理30s，間隔20s，循環(huán)50次。

③破碎后，4℃?8000rpm離心10min，分別收集上清和沉淀。