[發(fā)明專利]百合斑駁病毒雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010233082.6
• 申請日: 2010-07-22
• 公開（公告）號: CN101915835A
• 公開（公告）日: 2010-12-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 童勛章;謝忠奎;王亞軍;張玉寶;安麗萍;郭志鴻;張亞娟
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/535;C12N15/40;C12N15/63;C07K19/00;C07K16/10
• 代理公司: 甘肅省知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)中心 62100
• 代理人: 鮮林

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于植物病毒檢測的生物技術(shù)產(chǎn)品，具體涉及一種可用于對百合斑駁病毒病進(jìn)行快速靈敏檢測的百合斑駁病毒(LMoV)雙抗體夾心酶聯(lián)免疫(DAS-ELISA)檢測試劑盒，本發(fā)明還涉及該試劑盒的制備方法。

背景技術(shù)

百合(Lilium?spp.)傳統(tǒng)上是藥用和食用植物，現(xiàn)已成為國際上重要切花觀賞花卉之一。荷蘭是世界最大的百合種球生產(chǎn)國，2005年荷蘭百合種球生產(chǎn)面積達(dá)3800hm²，約占世界切花百合生產(chǎn)總面積的72％。切花百合在我國花卉產(chǎn)業(yè)產(chǎn)值中占第四位，同時(shí)百合作為食品和藥材，也是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物。隨著百合種植面積日益擴(kuò)大，高密度種植和長期無性繁殖使病毒不斷積累，病毒病對百合的危害日趨嚴(yán)重，影響了百合的產(chǎn)量和品質(zhì)，給百合種植業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。而百合的抗病毒品種極少，加上引種頻繁，鮮花進(jìn)出口頻率高，加速了病毒的傳播。據(jù)報(bào)道，現(xiàn)已知百合病毒病原有14種，類菌原體1種，其中為害嚴(yán)重的病毒有4種，即百合無癥病毒(Lily?symptomless?virus，LSV)、黃瓜花葉病毒(Cucumber?mosaic?virus，CMV)、百合斑駁病毒(Lily?mottlevirus，LMoV)和百合病毒X(Lily?virus?X，LVX)，其他各種病毒均為局部地區(qū)發(fā)生，百合病毒常復(fù)合侵染，不同病毒在百合上表現(xiàn)相似癥狀，同種病毒在不同條件下的癥狀有很大變異。

LMoV可在世界范圍內(nèi)廣泛分布，特別是在適合其寄主生長的所有溫帶地區(qū)及蚜蟲媒介豐富的地區(qū)尤為普遍。侵染百合科植物常造成嚴(yán)重的葉片斑駁癥狀、植株形態(tài)異常和球莖減小。百合斑駁病毒屬于馬鈴薯Y病毒科、馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)。病毒粒子呈彎曲線狀且呈螺旋對稱，大小(650～900)nm×(11～15)nm。病毒基因組為單分子正鏈RNA，約9.4kb，5’端缺少帽子結(jié)構(gòu)，連接一個(gè)VPg蛋白，3’端帶有Poly(A)尾。基因組包含一個(gè)長ORF，編碼相對分子質(zhì)量約340kDa的多聚蛋白，并通過病毒編碼的蛋白酶，即P1、HC-Pro和NIa切割形成十個(gè)不同大小的病毒蛋白。其中CP是外殼蛋白，分子量為30kDa，它一方面負(fù)責(zé)組裝病毒粒子包裹病毒RNA，另一方面參與蚜蟲介導(dǎo)的病毒傳播，而且靠近外殼蛋白的N端的氨基酸序列決定蚜蟲的傳播能力；CI是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含體蛋白，在病理組織細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成電鏡下特征明顯的風(fēng)輪狀結(jié)構(gòu)，可能與病毒的胞間運(yùn)動有關(guān)。

要減少病毒病在百合種植業(yè)中的損失，最便捷的方法是采用脫毒培養(yǎng)。國內(nèi)現(xiàn)在大量采用脫毒培養(yǎng)技術(shù)，但依然存在不少問題，其中之一就是是缺少方便快捷、準(zhǔn)確可靠的病毒檢測方法。

目前國內(nèi)外對百合斑駁病毒的主要檢測手段有指示植物檢測、電鏡檢測、分子生物學(xué)檢測和免疫學(xué)檢測等。其中指示植物檢測為較為傳統(tǒng)的檢測方法，測試條件受外界環(huán)境變化影響會出現(xiàn)不同的檢測結(jié)果，檢測周期也很長，操作十分復(fù)雜，檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。

電鏡檢測靈敏度不高，需要大量病毒樣本，檢測過程復(fù)雜，并且檢測結(jié)果受主觀影響較大。由于電子顯微鏡代價(jià)昂貴，對大多數(shù)檢測來說不具備條件。

分子生物學(xué)檢測方法操作較為簡單，通過病毒特異性引物進(jìn)行RT-PCR檢測，所需檢測時(shí)間較短。但由于該病毒是單鏈正鏈RNA病毒，制備用于檢測的樣本模板較為復(fù)雜，對檢測實(shí)驗(yàn)條件要求很高，且需要PCR儀等貴重儀器，檢測試劑昂貴。需要有相當(dāng)經(jīng)驗(yàn)的操作者才能獲得較為可靠的結(jié)果。

免疫學(xué)檢測方法基于病原的一種或多種蛋白質(zhì)與動物針對抗原產(chǎn)生的抗體間的相互作用。在植物病毒檢測中其優(yōu)勢在于：①反應(yīng)特異；②反應(yīng)迅速；③一定范圍內(nèi)可定量化；④靈敏；⑤抗血清可長期儲存；⑥適合批量檢測、操作難度低、檢測費(fèi)用低。因此適合作為大規(guī)模商業(yè)檢測方法推廣。

目前國內(nèi)外尚無商品化的LMoV免疫檢測試劑盒，著名植物病毒試劑盒檢測公司Agdia也僅有馬鈴薯Y病毒屬通用免疫試紙條實(shí)現(xiàn)了商品化，而沒有專一檢測LMoV的試劑盒，另外國外植物病毒診斷試劑價(jià)格昂貴，如Agdia公司試劑盒多在人民幣1500～4000元之間，很難滿足國內(nèi)花卉及食用百合的脫毒檢測需求。因此建立靈敏、穩(wěn)定、高通量和易操作的百合斑駁病毒檢測方法及試劑盒，是生產(chǎn)百合脫毒株的基礎(chǔ)，是提高花卉百合品質(zhì)和食用藥用百合產(chǎn)量和質(zhì)量的前提。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種準(zhǔn)確高效、經(jīng)濟(jì)簡便、易于推廣使用的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測方法及試劑盒，以及該試劑盒的制備方法。

本發(fā)明的技術(shù)問題通過下述技術(shù)方案解決：