[發明專利]百合斑駁病毒雙抗體夾心酶聯免疫檢測試劑盒及制備方法

有效

• 申請號: 201010233082.6
• 申請日: 2010-07-22
• 公開（公告）號: CN101915835A
• 公開（公告）日: 2010-12-15
• 發明（設計）人: 童勛章;謝忠奎;王亞軍;張玉寶;安麗萍;郭志鴻;張亞娟
• 申請（專利權）人: 中國科學院寒區旱區環境與工程研究所
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/535;C12N15/40;C12N15/63;C07K19/00;C07K16/10
• 代理公司: 甘肅省知識產權事務中心 62100
• 代理人: 鮮林

1.一種百合斑駁病毒雙抗體夾心酶聯免疫檢測試劑盒，包括輔助試劑：底物反應液、洗滌緩沖液、提取緩沖液、酶緩沖液、顯色劑及反應終止液，其特征在于還包括96孔多克隆抗體包被板、辣根過氧化物酶標記多克隆抗體、LMoV重組融合蛋白PI200標準品、質控品。

2.一種如權利要求1所述檢測試劑盒的制備方法，包括標準品的制備、多克隆抗體包被板的制備、酶標多克隆抗體的制備、質控品的制備以及輔助試劑的制備，其特征在于所述LMoV重組融合蛋白PI200標準品的制備，以感染LMoV的百合葉片的總RNA為模板，使用兩對引物CP-F/CP-R，CI200-F/CI200-R分別擴增LMoV的CP基因及CI200(CI基因C端600bp)片段，中間以(Gly)₅作為柔性連接，共同克隆入pET-28a載體得到重組質粒pET-28a-CP-CI200，表達得到大小56.5kDa的融合蛋白PI200。

3.如權利要求2所述檢測試劑盒的制備方法，其特征在于所述融合蛋白PI200的氨基酸序列為：

MGANETLNAGASSSTQASRSTRPEAAIDVAPQQSSEARVRDRDVDAGTVGTYQIPRLKALATKINVPKVKGRMIVNTGHLVNYNPDQTDISNTRSTQKQFETWYNAVKDEYGLNDESMALAMNGLMVWCIENGTSPNVNGVWLMMDGDQQVEFPLRPILEHAKPTLRQIMAHFSNLAEAYIEKQNLEKPYMPRYGLQRNLTDFNLARFAFDFYEVTSRTPARAKEAHFQMKTAALRGKQSKLFGLDGKVNTQDEDTERHTADDVNKNMHSLLGISMGGGGGASTMHPEVHRILTPYKLRDSEIILNKVAIPNKGLMQWPTAKEYAYQGFKMNIPDTVRLPFHSLDIPERLHERMWQIVETHKGDAGFGRITTASACKIAYTLKTDAASIQRTIHILDKLIENELKKQEYFRNITSASCSSSSFSLTTITNAIRARHIKDHTVENVSVLQAAKAQILEFKNVTFDLDHVNRMTEYGALECVQFQGNSSSVDKLAAALEHHHHHH。

4.如權利要求2所述檢測試劑盒的制備方法，其特征在于所述的重組蛋白PI200擴增外殼蛋白CP基因的引物設計為：

上游引物：5’-CCATGGGCGCAAATGAGACACTCAATGC-3’

??????????????NcoI???下游引物：5’-GAATTCCCGCTAGCTCCACCTCCTCCACCCATAGAAATTCCAAGTAAGGAGT-3’

?????????????EcoRI??NheI??(Gly)₅-Linker

5.如權利要求2所述檢測試劑盒的制備方法，其特征在于所述的重組蛋白PI200擴增細胞質內含體CI基因C端600bp的引物設計為：

上游引物：5’-GCTAGCACTATGCACCCAGAGGTACA-3’

??????????????Nhe?I

下游引物：5’-GAATTCCCCTGAAATTGGACACACTCC

??????????????EcoRI

6.如權利要求2所述檢測試劑盒的制備方法，其特征在于所述多克隆抗體包被板，用純化的融合重組蛋白PI200免疫獲得的多克隆抗體包被酶標板制作。

7.如權利要求2所述檢測試劑盒的制備方法，其特征在于所述多克隆酶標抗體，是用純化的融合重組蛋白PI200免疫兔獲得的多克隆抗體標記辣根過氧化物酶制作的。