[發明專利]一種用于特異性檢測新型H1N1流感病毒的合成多肽

無效

• 申請號: 201010233015.4
• 申請日: 2010-07-21
• 公開（公告）號: CN101906151A
• 公開（公告）日: 2010-12-08
• 發明（設計）人: 胡孔新;王琳;郭雪;楊鵬飛;平芮巾;張麗萍;馬雪征
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;C07K1/00;G01N33/569
• 代理公司: 北京中創陽光知識產權代理有限責任公司 11003
• 代理人: 尹振啟

技術領域

本發明涉及一種用于特異性檢測新型H1N1流感病毒的合成多肽。

背景技術

流行性感冒病毒簡稱流感病毒，是一類具有高度傳染性的呼吸道病毒，也是被列入生物恐怖武器的其中一種。目前檢測新型H1N1流感病毒的方法主要有病毒分離培養、逆轉錄多聚酶聯反應(RT-PCR)、血清學診斷和抗原檢測。但是，流感病毒分離鑒定所需的時間長、成本高，且需要在生物安全實驗室或國家指定研究機構進行，而RT-PCR則依賴于特定的設備、良好的實驗室條件和高素質的技術人員，難以在邊境口岸推廣應用，因此，亟待研究建立一種新型H1N1流感病毒快速、有效的抗原診斷技術。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明的目的在于提供一種用于特異性檢測新型H1N1流感病毒的合成多肽。

為實現上述目的，本發明特異性合成多肽序列為：CKYVKSTKLRLATGLRNVPS。

上述特異性合成多肽的篩選方法為：

(1)從NCBI數據庫中檢索、收集流感病毒HA亞型的氨基酸序列，利用DNA-STAR進行序列比對和同源性分析比對，篩選出HA分子中信號肽之后到蛋白酶切位點之間具有良好抗原性、親水性和易溶性分析的330-350區段和500-520區段作為候選片段；

(2)將篩選出的候選肽段與載體蛋白偶聯，獲得免疫抗體，通過特異性抗體的篩選，最終得到對新型H1N1流感病毒具有特異性的合成多肽，該多肽的位點為322-340，其序列為：CKYVKSTKLRLATGLRNVPS。

進一步，所述載體蛋白為KLH血藍蛋白。

上述步驟(2)具體為：

以包被免疫家兔的偶聯多肽檢測免疫血清，當兔多抗血清滴度已經達到1∶100000，進行終放血，收獲血清；

利用全病毒(H3N2、H1N1、新型H1N1)作為包被抗原對免疫兔的多克隆血清抗體進行篩選，其中，

包被液：稱取Na₂CO₃0.15g，NaHCO₃0.293g，蒸餾水稀釋至100ml，得到0.05mol/L?pH9.6碳酸緩沖液，4℃，保存；

洗滌液(稀釋液)：稱取NaCl?8g，KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄.12H₂O?2.9g，量取Tween-20，0.5ml，用蒸餾水加至1000ml，即為0.01mol/L?pH7.4PBS-Tween-20洗滌液，4℃，保存；

封閉液：5％脫脂奶粉或BSA的pH7.4PBS；

終止液：2mol/L的硫酸溶液；

然后按已知方式進行ELISA實驗，并根據實驗結果篩選出對新型H1N1流感病毒具有特異性的合成多肽，即：

1)包被抗原：用包被液將病毒作1000倍稀釋，反應板每孔加100ul，4℃冰箱保存至少12h；

2)洗滌：倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜置2min，反復三次，最后將反應板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡；

3)加封閉液200ul，37℃放置1h；

4)洗滌同2)；

5)加抗體：兔免疫血清用封閉液1∶500倍稀釋，反應板每孔加100ul，同時作稀釋液對照，37℃放置1h；

6)洗滌同2)；

7)加辣根過氧化物酶羊抗兔IgG(1∶1000倍稀釋)，反應板每孔100ul，37℃放置1h；

8)洗滌同2)；

9)加底物：加TMB100ml，室溫暗處放置15min；

10)加終止液：反應板每孔50ul；

11)觀察結果：用酶聯免疫檢測儀記錄490nm讀數。

本發明特異性合成多肽具有抗原制備簡單，不存在生物安全問題，且比天然微生物或寄生蟲蛋白抗原的特異性強，檢測抗體的假陰性率和本底反應都很低等優點，綜合流感病毒的診斷方法情況，以及當前全球防控流感的嚴峻形勢，本發明無疑具有較大的市場價值和社會效益。

具體實施方式

下面結合實例對本發明進行詳細說明。

本發明特異性合成多肽的篩選方法包括如下步驟：

(1)肽抗原表位的生物信息學選擇與合成、修飾