[發(fā)明專利]一種用于特異性檢測(cè)新型H1N1流感病毒的合成多肽

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010233015.4
• 申請(qǐng)日: 2010-07-21
• 公開（公告）號(hào): CN101906151A
• 公開（公告）日: 2010-12-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡孔新;王琳;郭雪;楊鵬飛;平芮巾;張麗萍;馬雪征
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C07K7/08
• 分類號(hào): C07K7/08;C07K1/00;G01N33/569
• 代理公司: 北京中創(chuàng)陽(yáng)光知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11003
• 代理人: 尹振啟

1.一種用于快速檢測(cè)新型H1N1流感病毒的特異性合成多肽，其特征在于，所述特異性合成多肽的序列為：CKYVKSTKLRLATGLRNVPS。

2.一種權(quán)利要求1所述特異性合成多肽的篩選方法，其特征在于，具體如下：

(1)從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索、收集流感病毒HA亞型的氨基酸序列，利用已知DNA-STAR進(jìn)行序列比對(duì)和同源性分析比對(duì)，篩選出HA分子中信號(hào)肽之后到蛋白酶切位點(diǎn)之間具有良好抗原性、親水性和易溶性分析的330-350區(qū)段和500-520區(qū)段作為候選片段；

(2)將篩選出的候選肽段與載體蛋白偶聯(lián)，獲得免疫抗體，通過特異性抗體的篩選，最終得到對(duì)新型H1N1流感病毒具有特異性的合成多肽，該多肽的位點(diǎn)為322-340，其序列為：CKYVKSTKLRLATGLRNVPS。

3.如權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于，所述載體蛋白為KLH血藍(lán)蛋白。

4.如權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于，所述步驟(2)具體為：

以包被免疫家兔的偶聯(lián)多肽檢測(cè)免疫血清，當(dāng)兔多抗血清滴度已經(jīng)達(dá)到1∶100000，進(jìn)行終放血，收獲血清；

利用全病毒(H3N2、H1N1、新型H1N1)作為包被抗原對(duì)免疫兔的多克隆血清抗體進(jìn)行篩選，其中，

包被液：稱取Na₂CO₃0.15g，NaHCO₃0.293g，蒸餾水稀釋至100ml，得到0.05mol/L?pH9.6碳酸緩沖液，4℃，保存；

洗滌液(稀釋液)：稱取NaCl?8g，KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄.12H₂O?2.9g，量取Tween-20，0.5ml，用蒸餾水加至1000ml，即為0.01mol/L?pH7.4PBS-Tween-20洗滌液，4℃，保存；

封閉液：5％脫脂奶粉或BSA的pH7.4PBS；

終止液：2mol/L的硫酸溶液；

然后按已知方式進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選出對(duì)新型H1N1流感病毒具有特異性的合成多肽，即：

1)包被抗原：用包被液將病毒作1000倍稀釋，反應(yīng)板每孔加100ul，4℃冰箱過夜(12h以上)；

2)洗滌：倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜置2min，反復(fù)三次，最后將反應(yīng)板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡；

3)加封閉液200ul，37℃放置1h；

4)洗滌同2)；

5)加抗體：兔免疫血清用封閉液1∶500倍稀釋，反應(yīng)板每孔加100ul，同時(shí)作稀釋液對(duì)照，37℃放置1h；

6)洗滌同2)；

7)加辣根過氧化物酶羊抗兔IgG(1∶1000倍稀釋)，反應(yīng)板每孔100ul，37℃放置1h；

8)洗滌同2)；

9)加底物：加TMB100ml，室溫暗處放置15min；

10)加終止液：反應(yīng)板每孔50ul；

11)觀察結(jié)果：用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀記錄490nm讀數(shù)。