[發明專利]土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌液體菌劑的制備方法

無效

• 申請號: 201010231423.6
• 申請日: 2010-07-20
• 公開（公告）號: CN102021118A
• 公開（公告）日: 2011-04-20
• 發明（設計）人: 孫榮高;鐘芳;李春杰;趙瑾;柴青
• 申請（專利權）人: 蘭州市南北兩山環境綠化工程指揮部;甘肅求實生物工程有限公司;蘭州大學草地農業科技學院
• 主分類號: C12N1/00
• 分類號: C12N1/00;C12N1/20;C02F3/34;C05F11/08;A23K1/16;C12R1/11;C12R1/07;C12R1/065
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責任公司 62102
• 代理人: 張真

技術領域：

本發明主要涉及微生物的菌劑制備方法，尤其涉及利用食品行業產生的廢液制備巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌三菌組合的液體菌劑的制備方法。?

背景技術：

傳統的微生物液體菌劑的制備方法，所用原料是葡萄糖、蛋白胨、糖蜜、牛肉膏、維生素，無機鹽和水配制成液體培養基，從試管斜面菌種上刮取菌苔接種在液體培養基中，經好氧或厭氧培養制備成液體菌劑，其缺點是：所用原料成本高，生產工藝復雜，不能節約能源。?

混合菌劑傳統做法，是將各種不同的菌種(好氧和厭氧)在各自不同的生長環境中培養菌種，然后從每個菌種的培養物中刮取菌苔制取每個菌的液體菌懸液，再轉種于各自的液體培養液經通氣或厭氧發酵培養后離心制取活性細胞菌，將沉淀物噴霧干燥制成粉劑，制成多菌的混合。其缺點是：制備工藝復雜，發酵周期長，成本高，應用受到限制。?

發明內容：

本發明的目的在于避免現有微生物液體菌劑生產技術不足之處而提供一種土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌液體菌劑的制備方法。使用巨大芽孢桿菌與膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌科學配伍，以新鮮豆腐或粉絲或玉米或洋芋淀粉產生的廢水為原料，添加少量無機鹽制備巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌液體菌劑。?

本發明的目的可以通過采用以下技術方案實現：一種土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌液體菌劑，其主要特點在于由巨大芽孢桿菌(Bacillus?megaterium)、膠凍樣芽孢桿菌(Bacillus?mucilaginosus)、圓褐固氮菌(Azotobacter??chroococcum)和液體培養基組成，其三種菌株的重量百分比為巨大芽孢桿菌為55～65％、膠凍樣芽孢桿菌為30～35％、圓褐固氮菌5～10％，所述的巨大芽孢桿菌的保藏號為CGMCC?No.3770；所述的膠凍樣芽孢桿菌的保藏號為CGMCC?No.3769；所述的圓褐固氮菌的保藏號為CGMCC?No.3768。?

所述的土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌液體菌劑，所述的液體培養基包括有在1升新鮮豆腐廢水或粉絲廢水或玉米淀粉廢水或洋芋淀粉廢水中加入硫酸銨1-2g，磷酸0.5-1ml，用1％的石灰水調pH?7.2-7.5。?

一種土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和圓褐固氮菌液體菌劑的制備方法，其主要特點在于有如下步驟：?

A.土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌瓊脂斜面培養基的制備及菌種的培養：?

a.瓊脂斜面培養基的制備：麥芽汁0.5-2％、葡萄糖0.5-2％、蛋白胨0.2-0.6％、瓊脂粉1-3％、無菌水80-120ml，加熱溶解后，用1％的氫氧化鈉調pH值至7.0-7.5，經110-114℃，30-35分鐘蒸汽滅菌，然后在無菌條件下分裝于15×1.5cm的干燥滅菌的試管擺成斜面待凝固后備用；?

b.土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌菌種的培養：分別取巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌的母種瓊脂斜面菌，在無菌條件下，轉種于上述制備的瓊脂斜面培養基上，經28-32℃、24-48小時培養，即得瓊脂斜面菌種，為巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌一級菌種；?

B.所述土著益生圓褐固氮菌瓊脂斜面培養基的制備及菌種的培養：?

a.瓊脂斜面培養基的制備：磷酸二氫鉀0.01-0.03％，硫酸鎂0.01-0.03％，氯化納0.01-0.03％，碳酸鈣0.4-0.6％，甘露醇0.8-1.2％，硫酸鈣0.08-0.12％，瓊脂1.8-2.2％，水80-120毫升，加熱溶解用1％的氫氧化納調pH值6.8-7.0，經110-114℃，30-35分鐘蒸汽滅菌，然后在無菌條件下，分裝于15×1.5cm干燥滅菌的試管擺成斜面待凝固后備用；?

b.土著益生圓褐固氮菌菌種的培養：取土著益生圓褐固氮菌的母種瓊脂斜面菌，在無菌條件下轉種于上述制備的瓊脂斜面培養基上，經28-32℃，48-32h，即得瓊脂斜面菌種，為圓褐固氮菌一級菌種；?

C土著益生巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌、圓褐固氮菌液體培養基的制備及液體菌種的培養：?

a.液體培養基的制備：在1升新鮮豆腐廢水或粉絲廢水或玉米淀粉廢水或洋芋淀粉廢水中加入硫酸銨1-2g，磷酸0.5-1ml，用1％的石灰水調pH?7.0-7.5，分裝于?500ml三角燒瓶中，分裝量為瓶子容量的1/4，然后經110-112℃，30-35分鐘高壓滅菌，冷卻后備用；?