[發明專利]抗魏氏梭菌病轉基因植物疫苗及其制作方法

有效

• 申請號: 201010231142.0
• 申請日: 2010-07-20
• 公開（公告）號: CN102008720A
• 公開（公告）日: 2011-04-13
• 發明（設計）人: 劉松梅;李一經;葛俊偉;朱延明
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: A61K39/08
• 分類號: A61K39/08;C12N15/31;C12N15/82;A61P31/04
• 代理公司: 哈爾濱東方專利事務所 23118
• 代理人: 陳曉光

技術領域：

本發明涉及一種抗魏氏梭菌病轉基因植物疫苗及其制作方法。?

背景技術：

魏氏梭菌(Clostridium?welchii)，又稱產氣莢膜梭菌(Clostridium?perfringens)是動物腸道正常菌群之一，也是引起魏氏梭菌病的原兇。其發病機理是在飼養環境和飼料突然改變等誘因下，腸道內魏氏梭菌大量繁殖，產生的毒素經消化道吸收，導致動物出現腸毒血癥，壞死性腸炎，綿羊軟腎病，仔豬紅痢、羔羊痢疾、兔出血性下痢，創傷性氣性壞疽，動物猝死癥等。根據菌體分泌外毒素不同，將魏氏梭菌分為五個血清型，即A、B、C、D、E型(見表1)。外毒素是魏氏梭菌的毒力因子，目前已發現有15種之多，但致死性因子只有4種，即α、β、ε和ι，其中最根本、最重要的致病因子——α毒素(C.perfringens?alpha?toxin，CPA)是A～E型所共有的毒力因子。α毒素具有磷脂酶C(PhospholipaseC，PLC)和鞘磷脂酶(Sphingomyelinase)活性，能水解卵磷脂和鞘磷脂使細胞膜破裂，因而具有溶血性、細胞毒性、致死性和皮膚壞死等特性。?

表1各型魏氏梭菌及其主要分泌毒素?

注：“+”表示分泌毒素；“-”表示不分泌毒素。?

自八十年代中期有報道以來，全國約有二十個多個省市的兔、牛、羊、豬群中出現了一種發病呈超急性經過，死亡快，死亡率高的頑癥，根據其發病急、死亡快的特點定名為“猝死癥”。農業部在90年代中期曾組織科研人員在山東、四川、河南、吉林、湖北、寧夏等地進行調查，經過對病原分離鑒定證明家畜“猝死癥”與魏氏梭菌的感染有直接關系。我國各地每年反芻動物壞死性腸炎或腸毒?血癥、羔羊和仔豬紅痢的發病率呈上升趨勢，給養殖業帶來了巨大的經濟損失。魏氏梭菌對人類危害亦較大，特別是一次世界大戰期間，受傷戰士氣性壞疽的發病率和死亡率都很高，氣性壞疽以局部水腫、產氣、肌肉壞死及全身中毒為特征，英國士兵中該病占外傷的比例高達12％，引發傷口感染奪去了15萬軍人的生命；在我國四川省汶川大地震中，很多人也因為傷口感染魏氏梭菌，產生氣性壞疽而不得不截肢。同時，魏氏梭菌還能引起人類食物中毒，在美國等西方國家，魏氏梭菌引起的食物中毒排在第二位；在我們國家該菌引起的食物中毒，僅次于沙門氏菌和金黃色葡萄球菌。?

魏氏梭菌的致病性主要是外毒素作用而誘發的，抗生素只能對魏氏梭菌本身起作用，對細菌已經釋放到血液中的毒素沒有任何作用，這就導致本病一旦發生，往往來不及治療即很快死亡，可見，預防魏氏梭菌病的意義遠遠大于治療。為了防治魏氏梭菌引起的動物壞死性腸炎，目前通常采用的方法是在飼料中加入抗菌素類藥物飼料添加劑，但這常常會帶來獸藥殘留的問題，并且可能會導致耐藥菌株的產生。所以，疫苗接種是預防該病的主要途徑，生產高效保護性疫苗一直是研發的熱點。目前普遍使用的類毒素疫苗、多聯疫苗、基因工程疫苗，雖有一定效果但保護率都較低；常規疫苗還存在一定的缺陷，如滅活不徹底，毒力返強等風險，且成本較高，所以亟待一種新型治療方法出現。?

魏氏梭菌外毒素的化學成分為蛋白質，具有良好的免疫原性，國外研究表明類毒素疫苗對本病的預防能夠達到確實可靠的效果。郭明章(1988)報道，家兔免疫魏氏梭菌菌苗后第5天血清中開始出現毒素抗體，1個月左右達最高峰為6.0log2。劉文波(2002)在國內首次研制了魏氏梭菌類毒素疫苗，家兔免疫后能產生較高水平的毒素抗體。柴同杰(2005)研究表明魏氏梭菌類毒素鋁膠苗免疫家兔后第一周抗毒素水平為1.125log2，高峰時達到7.125log2，17周抗體效價為4.7log2。呂靜(2009)對A型魏氏梭菌類毒素油乳劑疫苗和滅活菌苗免疫家兔進行比較，滅活菌苗接種部位均有肉芽腫現象，類毒素疫苗除個別有輕微肉芽腫外幾乎未產生不良反應，可見油乳劑類毒素疫苗對動物安全性高；免疫后用強毒攻擊，油乳劑類毒素疫苗保護率達到100％，未出現不良反應，滅活菌苗達到75％的保護率，且未死亡家兔精神不振，有輕微腹瀉；免疫家兔后對抗體水平進行比較，油乳劑類毒素疫苗的免疫效果明顯優于滅活菌苗，與國外Uzal研究基本一致。?本發明抗魏氏梭菌病轉基因植物疫苗預防疾病的原理與類毒素疫苗相似。?