[發(fā)明專利]抗魏氏梭菌病轉(zhuǎn)基因植物疫苗及其制作方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010231142.0
• 申請日: 2010-07-20
• 公開（公告）號: CN102008720A
• 公開（公告）日: 2011-04-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉松梅;李一經(jīng);葛俊偉;朱延明
• 申請（專利權(quán)）人: 東北農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: A61K39/08
• 分類號: A61K39/08;C12N15/31;C12N15/82;A61P31/04
• 代理公司: 哈爾濱東方專利事務所 23118
• 代理人: 陳曉光

1.一種抗魏氏梭菌病轉(zhuǎn)基因植物疫苗的制作方法，其特征是：該方法包括：

(1)以含編碼魏氏梭菌α毒素的質(zhì)粒或病料為模板，利用PCR或RT-PCR擴增獲得魏氏梭菌α毒素基因，將獲得的魏氏梭菌α毒素基因和Ti質(zhì)粒分別進行酶切，回收目的基因和植物表達載體片段，連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，對重組Ti進行酶切、PCR和測序鑒定，用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌，篩選、PCR鑒定獲得陽性重組根瘤農(nóng)桿菌pA：已于2010年6月2日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為：CCTCC?NO：M?2010130。

(2)植物種子經(jīng)春化、萌發(fā)、剪接，獲得外植體，用步驟(1)中重組的根瘤農(nóng)桿菌pA分別侵染外植體，通過篩選、繼代、生根、移栽，獲得轉(zhuǎn)化植株，篩選鑒定轉(zhuǎn)基因陽性植株，提取轉(zhuǎn)基因植物基因組或蛋白進行Southern?blot、Northern?blot或Western?blot鑒定，證明魏氏梭菌毒素在植物中得到表達。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗魏氏梭菌病轉(zhuǎn)基因植物疫苗的制作方法，其特征是：步驟(1)中所述的魏氏梭菌α毒素也可以采用魏氏梭菌α毒素和/或魏氏梭菌β毒素和/或魏氏梭菌ε毒素和/或魏氏梭菌ι毒素；所述的Ti質(zhì)粒也可以采用Ri質(zhì)粒，同時所述的根瘤農(nóng)桿菌采用發(fā)根農(nóng)桿菌。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗魏氏梭菌病轉(zhuǎn)基因植物疫苗的制作方法，其特征是：步驟(2)中所述的植物包括牧草或蔬菜或農(nóng)作物或水果或模式植物，所述的牧草包括苜蓿，所述的蔬菜包括馬鈴薯，所述的農(nóng)作物包括玉米，所述的水果包括西紅柿，所述的模式植物包括煙草。

4.一種利用權(quán)利要求1-3的方法制作的抗魏氏梭菌病轉(zhuǎn)基因植物疫苗，其特征是：所述的抗魏氏梭菌病轉(zhuǎn)基因植物疫苗為直接口服疫苗，或者將植物表達的蛋白抗原經(jīng)提取、加工成口服或注射制劑使用。

5.一種抗魏氏梭菌病轉(zhuǎn)基因植物疫苗的制作方法，其特征是：該方法包括：

(1)以含黏膜佐劑大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素B亞單位(LT-B)的質(zhì)粒或病料為模板，利用PCR或RT-PCR擴增獲得黏膜佐劑LT-B基因，以含編碼魏氏梭菌α毒素的質(zhì)粒或病料為模板，利用PCR或RT-PCR擴增獲得魏氏梭菌α毒素基因，將所述的黏膜佐劑LT-B基因與所述的魏氏梭菌α毒素基因融合獲得融合基因，將獲得融合基因和Ti質(zhì)粒分別進行酶切，回收目的基因和植物表達載體片段，連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，對重組Ti質(zhì)粒進行酶切、PCR和測序鑒定，用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌，篩選、PCR鑒定獲得陽性重組根瘤農(nóng)桿菌pLA：已于2010年6月2日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為：CCTCC?NO：M?2010131。

(2)植物種子經(jīng)春化、萌發(fā)、剪接，獲得外植體，用步驟(1)中重組的根瘤農(nóng)桿菌pLA分別侵染外植體，通過篩選、繼代、生根、移栽，獲得轉(zhuǎn)化植株，篩選鑒定轉(zhuǎn)基因陽性植株，提取轉(zhuǎn)基因植物基因組或蛋白進行Southern?blot、Northern?blot或Western?blot鑒定，證明魏氏梭菌毒素在植物中得到表達。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗魏氏梭菌病轉(zhuǎn)基因植物疫苗的制作方法，其特征是：步驟(1)中所述的大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素B亞單位(LT-B)或者采用霍亂毒素B亞基(CT-B)。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗魏氏梭菌病轉(zhuǎn)基因植物疫苗的制作方法，其特征是：步驟(1)中所述的魏氏梭菌α毒素也可以采用魏氏梭菌α毒素和/或魏氏梭菌β毒素和/或魏氏梭菌ε毒素和/或魏氏梭菌ι毒素；所述的Ti質(zhì)粒或者采用Ri質(zhì)粒，同時所述的根瘤農(nóng)桿菌采用發(fā)根農(nóng)桿菌。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗魏氏梭菌病轉(zhuǎn)基因植物疫苗的制作方法，其特征是：步驟(2)中所述的植物包括牧草或蔬菜或農(nóng)作物或水果或模式植物，所述的牧草包括苜蓿，所述的蔬菜包括馬鈴薯，所述的農(nóng)作物包括玉米，所述的水果包括西紅柿，所述的模式植物包括煙草。

9.一種利用權(quán)利要求5-8方法制作的抗魏氏梭菌病轉(zhuǎn)基因植物疫苗，其特征是：所述的抗魏氏梭菌病轉(zhuǎn)基因植物疫苗為直接口服，還為將植物表達的蛋白抗原經(jīng)提取、加工成口服或注射制劑使用。