[發(fā)明專利]幽門(mén)螺桿菌胸苷酸合成酶ThyX的晶體及制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010230809.5
• 申請(qǐng)日: 2010-07-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101892203A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-11-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄒全明;張曉麗;章金勇;郭鷹;石云;毛旭虎;郭剛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/00
• 分類號(hào): C12N9/00;C12N15/52;C12N15/63
• 代理公司: 重慶志合專利事務(wù)所 50210
• 代理人: 胡榮琿

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和應(yīng)用微生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及幽門(mén)螺桿菌的胸苷酸合成酶ThyX的晶體及制備方法。

背景技術(shù)

幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter?pylori，H.pylori)為革蘭陰性微需氧菌，是慢性胃炎、胃十二指腸潰瘍的重要致病因素，與胃癌、胃粘膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤發(fā)生密切相關(guān)，世界衛(wèi)生組織已將其列位一類致病因子。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界人群H.pylori感染率超過(guò)50％，而且目前臨床上采用抗生素治療H.pylori感染所面臨多藥耐藥形勢(shì)日趨嚴(yán)峻。因此，篩選和發(fā)現(xiàn)新的藥物治療靶點(diǎn)成為近年來(lái)的一大研究熱點(diǎn)，這對(duì)有效預(yù)防和治療H.pylori感染，具有重要的理論指導(dǎo)意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。

1、胸苷酸合酶在DNA的合成中發(fā)揮了重要的作用，H.pylori和人體細(xì)胞的胸苷酸合酶的蛋白結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制完全不同，而且前者還可能與H.pylori感染引發(fā)的潰瘍密切相關(guān)，這些使其成為一個(gè)理想的藥物靶點(diǎn)。

核苷酸是脫氧核糖核酸(DNA)的合成原料，是生物體遺傳和細(xì)胞代謝的必需物質(zhì)。脫氧胸腺嘧啶核苷酸(dTMP)沒(méi)有相應(yīng)的核糖核苷酸，不能由核糖核苷酸直接還原得到。除了一些低等生物可以通過(guò)胸苷酸激酶分解利用外源性的核苷酸之外，幾乎所有的生物都必須擁有自身的胸苷酸合酶以滿足新陳代謝的需要，生物細(xì)胞主要都通過(guò)下列兩種方式合成dTMP。大多數(shù)生物細(xì)胞包括人體都是通過(guò)A途徑合成dTMP的，但在某些致病菌包括H.pylori以及dsDNA病毒，由于缺乏編碼二氫葉酸還原酶(FolA)的基因而不能實(shí)現(xiàn)葉酸循環(huán)，同時(shí)不含有胸苷酸激酶不能利用外源性的核苷酸，只能通過(guò)B途徑合成dTMP。因此，人體細(xì)胞和H.pylori是通過(guò)兩種不同的胸苷酸合酶(ThyA和ThyX，即TS和FDTS)以兩種截然不同的方式合成自身所需的dTMP。研究表明，ThyX和ThyA雖然都催化dTMP的合成，但是二者的氨基酸序列、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制都完全不同，二者之間不存在交叉作用。除此之外，研究表明：ThyX本身還與H.pylori感染后潰瘍的發(fā)生密切相關(guān)，是一種重要的致病因子。因此，ThyX是H.pylori抗菌藥物設(shè)計(jì)中一個(gè)良好的靶標(biāo)。

2、胸苷酸合酶由于其在DNA代謝和基因表達(dá)調(diào)控中的重要作用，成為近年來(lái)小分子抑制劑設(shè)計(jì)的重要靶標(biāo)，主要應(yīng)用在抗腫瘤和抗感染方面。

選擇性的ThyX抑制劑可以使致病菌因胸苷酸合成障礙而死亡；同時(shí)，由于人類的細(xì)胞中只含有ThyA，因此又可以盡量降低藥物的毒副作用；因此，很多針對(duì)ThyX的抑制劑用于抗感染方面。同時(shí)研究表明，胸苷酸合酶具有雙重功能，它參與了dTMP的合成；作為一種調(diào)節(jié)蛋白它通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)一些細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，因此在抗腫瘤研究中有很好的應(yīng)用前景，早在2002年，就有5種胸苷酸合酶的抑制劑在臨床上應(yīng)用于腫瘤的治療(raltitrexed，pemetrexed，nolatrexed，ZD9331，and?GS7904L)，近年來(lái)，針對(duì)ThyA的抗腫瘤小分子不斷增加，在腫瘤化療中發(fā)揮了重大作用。另外，通過(guò)對(duì)不同致病菌ThyX序列比對(duì)表明，雖然ThyX在各個(gè)菌株之間同源性不高，但在參與底物結(jié)合的26個(gè)關(guān)鍵殘基中，有16個(gè)是完全保守的，因此可能具有相同或相似的活性中心和底物結(jié)合口袋。以上這些研究結(jié)果說(shuō)明，通過(guò)胸苷酸合酶抑制劑抑制dTMP的合成來(lái)抗感染和抗腫瘤是可行的，這也為針對(duì)H.pylori的胸苷酸合酶ThyX的抑制劑設(shè)計(jì)提供了一些指導(dǎo)意義。同時(shí)，由于ThyX催化的反應(yīng)涉及到多種底物和輔酶的參與，包括底物dUMP和輔酶FAD和亞甲基四氫葉酸以及NADP⁺/NADPH⁺，底物或輔酶的類似物都可以作為酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，從而增加了抑制劑的篩選范圍。

3、蛋白的結(jié)構(gòu)是功能的基礎(chǔ)，解析ThyX的蛋白結(jié)構(gòu)，對(duì)確定其活性中心、底物結(jié)合模式、深入研究其催化機(jī)制以及小分子抑制劑的設(shè)計(jì)具有重要的理論指導(dǎo)意義和醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。

蛋白質(zhì)表達(dá)(蛋白質(zhì)組學(xué))以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(結(jié)構(gòu)生物學(xué))的研究，與人類疾病相關(guān)基因的識(shí)別、鑒定及其所表達(dá)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的研究為藥物篩選與發(fā)現(xiàn)開(kāi)拓了不可限量的前景，給新藥發(fā)現(xiàn)帶來(lái)了契機(jī)，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，研究者開(kāi)始以蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)進(jìn)行先導(dǎo)化合物的藥物篩選，這類篩選方法包括：

基于蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的虛擬藥物篩選和設(shè)計(jì)(計(jì)算機(jī)輔助的藥物設(shè)計(jì))。