[發明專利]臨床用N-CIK細胞培養、質量控制鑒定試劑盒及應用

有效

• 申請號: 201010230547.2
• 申請日: 2010-07-19
• 公開（公告）號: CN101914497A
• 公開（公告）日: 2010-12-15
• 發明（設計）人: 徐峰波
• 申請（專利權）人: 濟南迪博生物技術有限公司;徐峰波
• 主分類號: C12N5/078
• 分類號: C12N5/078;C12N5/0783;G01N33/53;G01N21/64;C12Q1/02;A61K35/14;A61P35/00
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技術領域

本發明涉及生物技術和生物、免疫學領域。特別地，本發明涉及NK和CIK(即N-CIK)細胞的誘導、培養及產品質量控制鑒定的試劑盒及N-CIK細胞在腫瘤綜合治療中的應用。

背景技術

腫瘤作為人類死亡的重要病因之一，已經成為威脅人類健康的首要問題并受到社會的廣泛關注。隨著腫瘤治療方法不斷發展，目前手術治療、放射治療、化療以及聯合生物治療的綜合治療已經成為腫瘤治療的新觀點。

雖然現有的腫瘤治療方法仍不能徹底根治腫瘤，借助生物免疫學技術手段開展腫瘤免疫治療提高腫瘤患者生活質量和生存期，已經越來越受到業界的認同。尤其是以自體來源的活化T細胞為代表的免疫治療技術，因其毒副作用小，綠色、個性化的特點在臨床上逐漸受到重視。

隨著腫瘤學和免疫學的進步，腫瘤免疫治療，包括特異性主動免疫治療和過繼免疫治療兩個方面的研究都有了很大的發展，前者包括以樹突狀細胞為基礎的技術現已被國內外專家作為研究課題，但距臨床大規模應用還有待時日。

然而腫瘤過繼免疫治療技術已得到了較快發展，先后出現了以幾種免疫效應細胞為代表的治療技術，并在臨床上得到了較為廣泛的推廣應用。最早出現的淋巴因子激活的殺傷細胞((LAK細胞)(Rosenberg?SA，et?al.N.Engl.J.Med.1985，313(23)：1485-92.)，它主要是成分是NK細胞(CD3-CD56+)；其后出現了腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL細胞)(Itoh?K，et?al.J?Exp.Med.1988，168(4)：1419-41.)以及細胞毒T淋巴細胞(CTL)(Aruga?A，et?al.?Int.J.Cancer.1991，49(1)：19-24.)，它們多是以大量CD8+或者CD4+T淋巴細胞為主要效應細胞；而1991年由斯坦福大學發明的細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK細胞)的主要成分是CD3+CD56+，它兼有NK細胞和T淋巴細胞的功能特點，臨床應用表現出更好的應用特性，尤其是NK細胞和CD8+T淋巴細胞(亦即毒性T淋巴細胞，Tc)的強細胞毒性作用，使該項細胞免疫技術在臨床上顯示出了良好療效，受到臨床上廣泛推廣。

目前現有技術已嘗試在不同方面發展了CIK技術，如CN101506356是在LAK技術的基礎上提高了CD3+CD56+的比例，而CN101519646A公開的結果顯示獲得了CD3+CD56+和CD8+T細胞的雙提高，但細胞的有效成分都不夠全面，而且對免疫細胞質量控制和鑒定無做相應規范要求，沒有涉及試劑盒形式的誘導培養、制備N-CIK細胞以及產品質量控制鑒定；但事實上的臨床應用中，受制備使用試劑和因子較多、周期較長、標準不一致的限制，出現了培養工藝繁瑣、不穩定、細胞質量難以控制甚至污染的問題。而處在臨床研究階段的樹突狀細胞疫苗的制備，在CN16091095A中已經公開了一種簡單的試劑盒制備方法，未來有望改善其臨床應用中培養方法復雜的問題。

長期的N-CIK細胞臨床應用實踐提示我們，未形成簡單的、格式化的試劑盒模式或者統一的培養工藝模式已成為束縛N-CIK細胞臨床長期穩定應用的瓶頸，迫切需要開發高效、快速制備N-CIK細胞的方法和模式。

發明內容

本發明的目的是為了克服上述N-CIK細胞(NK和CIK細胞)臨床應用中存在的瓶頸問題，提供一種臨床用N-CIK細胞的高效、快速制備的方法、相關組合物和試劑盒及其應用。

本發明人對細胞的誘導、培養以及產品的質量控制鑒定進行了優化和完善，通過一套N-CIK細胞的誘導、培養以及產品質量控制鑒定的試劑盒形式，規范了N-CIK細胞的臨床高效安全應用，為N-CIK細胞高效快速制備和臨床應用培養工藝控制、質量標準統一提出了新模式。此外，本發明還豐富了效應細胞有效成分，本方法獲得的N-CIK細胞包含了NK細胞、CD3+CD56+和CD8+T細胞在內的多種對腫瘤細胞具有殺傷毒性的成分。

本發明一方面提供一種臨床用N-CIK細胞無血清液態完全培養基，它含有人體細胞生長必需的碳水化合物、氮源、維他命、礦物質和水，并添加一定體積比的細胞培養添加劑，包括非必須氨基酸、丙酮酸鈉、青霉素鈉以及硫酸鏈霉素。

本發明還提供一種N-CIK細胞誘導因子組合物NC-1，它含有人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、人干擾素γ和RPMI?1640，且人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、人干擾素γ的質量體積濃度分別為：0.5～1mg/L和20～80mg/L。