[發(fā)明專利]一種PCR微陣列檢測多種流感病毒的試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010229512.7
• 申請日: 2010-07-16
• 公開（公告）號: CN102337352A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李明;陳華云;高秀潔
• 申請（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64;C12N15/11
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• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種PCR微陣列檢測多種流感病毒的試劑盒，該試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)結(jié)合微陣列方法，能在同一個(gè)反應(yīng)板上同時(shí)進(jìn)行多種流感病毒核酸檢測.。

背景技術(shù)

流行性感冒病毒，簡稱流感病毒，是一種造成人類及動(dòng)物患流行性感冒的RNA病毒，屬于正黏液病毒科。流感病毒侵襲的目標(biāo)是呼吸道粘膜上皮細(xì)胞，感染后會造成急性上呼吸道感染，是高度接觸傳染性的群發(fā)性呼吸道疾病，嚴(yán)重時(shí)可累及心肺等人體重要器官。由于流感病毒可經(jīng)由空氣傳播，且會引起大范圍的流行，尤其是在免疫力低下的人群中會引起嚴(yán)重癥狀，如肺炎，心力衰竭等。臨床以突發(fā)，高熱，咳嗽，呼吸困難，衰竭，高發(fā)病率，低死亡率為主要特征。

根據(jù)流感病毒感染的對象，將病毒分為人類流感病毒，豬流感病毒，禽流感病毒等類群。其中人類流感病毒根據(jù)其病毒核蛋白的抗原性分為甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒，又稱A型、B型、C型流感病毒。甲型流感病毒根據(jù)其核蛋白抗原的不同分為H1～H15共15個(gè)亞型，人類對15個(gè)亞型中的H1和H3亞型易感。禽流感病毒屬于甲型流感病毒，世界各地爆發(fā)的禽流感主要由高致病性的H5、H7、H9三種亞型引起的。2009年爆發(fā)的甲型H1N1流感是由甲型H1N1流感病毒引起的。流感的爆發(fā)已有百年的歷史，每次流感疫情均給經(jīng)濟(jì)發(fā)展和公共衛(wèi)生帶來巨大的損失，因此建立快速檢測流感病毒的診斷技術(shù)是預(yù)防和控制該疾病流行的一個(gè)重要保障。

目前，作為檢測流感病毒的方法主要有以下幾種：(1)病毒分離鑒定。采用雞胚和/或MDCK細(xì)胞進(jìn)行流感病毒分離。樣本制成懸液接種于10～11日齡雞胚尿囊腔，48h后收集尿囊液，可再以MDCK細(xì)胞培養(yǎng)以收獲病毒培養(yǎng)液或進(jìn)行滴度鑒定。該方法檢測時(shí)間長且對操作者要求比較高；(2)血清學(xué)方法，也是病毒鑒定的常規(guī)手段，通過血清學(xué)鑒定來判斷病毒的種屬和亞型。但實(shí)驗(yàn)過程中常受到非特異性凝集因素、抗體特異性等方面干擾，對抗原的標(biāo)準(zhǔn)化、單克隆抗體制備技術(shù)等方面提出更嚴(yán)格的要求。(3)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測方法，具有簡便、快速、靈敏度高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于流感病毒的核酸檢測。針對特異性序列位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物和探針，可同時(shí)檢測多種病毒核酸，滿足高通量快速檢測的需求。

PCR微陣列反應(yīng)是利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)結(jié)合微陣列的方法來檢測多種病毒，可以滿足高通量，快速檢測的要求。具體的來說，在96或384孔板的各孔中分別加入不同病毒核酸特異性引物和熒光探針制成PCR微陣列反應(yīng)板，使用時(shí)每孔加入等量的PCR反應(yīng)液，再將病毒核酸樣本加入反應(yīng)體系中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在同一反應(yīng)條件下同時(shí)進(jìn)行多管PCR反應(yīng)，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)多種病毒核酸的高通量檢測。除此之外，每一種待檢的病毒分別設(shè)置陽性和陰性質(zhì)控品，進(jìn)行質(zhì)量控制和環(huán)境監(jiān)控。按照合理有序，96或384孔板上的排列方式依照不易污染且易于操作的原則。PCR微陣列一次性可檢測多種病毒，尤其當(dāng)需要對臨床癥狀相近病原體進(jìn)行鑒別或?qū)νN屬病原體分型時(shí)，PCR微陣列方法可迅速確定病原體，從而節(jié)省了在數(shù)據(jù)分析方面所花費(fèi)的時(shí)間，在更短的時(shí)間內(nèi)得到多種病毒核酸檢測的數(shù)據(jù)信息。在流感病毒的鑒別診斷和監(jiān)控方面，尤其針對流感疫情病原體快速排查，該技術(shù)將發(fā)揮巨大優(yōu)勢。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種PCR微陣列方法檢測多種流感病毒的試劑盒，該試劑盒可以同時(shí)檢測包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、季節(jié)性流感病毒H1亞型、H3亞型、甲型H1N1流感病毒、高致病性禽流感病毒H5亞型、H7亞型、H9亞型8種流感病毒。

本發(fā)明在對GENBANK上所有已知的流感病毒核酸序列進(jìn)行比對的基礎(chǔ)上，尋找待檢流感病毒核酸序列的特異性保守區(qū)，并針對保守區(qū)設(shè)計(jì)各病毒靶多核苷酸引物和探針。這些引物探針在含有逆轉(zhuǎn)錄酶、高質(zhì)量的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)以及Mg²⁺等的PCR反應(yīng)液中，通過熒光PCR儀實(shí)現(xiàn)體外核酸的循環(huán)擴(kuò)增，從而達(dá)到一次性快速檢測多種流感病毒核酸的目的。

本發(fā)明所涉及的試劑盒中主要包括：1)PCR微陣列反應(yīng)板、PCR反應(yīng)液，2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。

本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是PCR微陣列反應(yīng)板由PCR反應(yīng)板以及加在各反應(yīng)孔中的引物探針混合液所組成，其中PCR反應(yīng)板可選擇市售的96孔PCR反應(yīng)板或384孔板PCR反應(yīng)板，如Bioplastic公司產(chǎn)品。

本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，引物探針混合液包括引物和探針，其中引物終濃度均為0.2mmol/L，探針終濃度均為0.1mmol/L。