[發(fā)明專利]一種mRNA定量檢測(cè)方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010228695.0
• 申請(qǐng)日: 2010-07-16
• 公開（公告）號(hào): CN101887023A
• 公開（公告）日: 2010-11-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張耀川;白素蘭
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院
• 主分類號(hào): G01N21/78
• 分類號(hào): G01N21/78;G01N21/31;C12Q1/68
• 代理公司: 北京永創(chuàng)新實(shí)專利事務(wù)所 11121
• 代理人: 周長(zhǎng)琪

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種采用光學(xué)薄膜生物傳感器芯片直接量化樣品中的mRNA含量的方法，即mRNA定量檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

對(duì)樣品中mRNA的定量檢測(cè)技術(shù)在分子生物學(xué)技術(shù)中有很重要的作用。如微陣列分析中cDNA探針的合成，Northern雜交(RNA與DNA的雜交)分析前RNA濃度的確定，cDNA文庫構(gòu)建，RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄酶PCR)反應(yīng)和PCR差異顯示實(shí)驗(yàn)等都涉及到對(duì)mRNA的定量檢測(cè)。傳統(tǒng)的mRNA定量檢測(cè)方法包括分光光度檢測(cè)方法、瓊脂糖變性膠檢測(cè)方法、Northern雜交檢測(cè)方法等。

分光光度檢測(cè)方法是最常用的RNA定量檢測(cè)方法，即在光波波長(zhǎng)為260nm的紫外光條件下，通過測(cè)量樣品對(duì)紫外光的吸光率來估測(cè)樣品中總RNA的含量。這種方法雖然容易操作，但缺點(diǎn)是：在RNA準(zhǔn)備過程中，自由核甘酸、蛋白質(zhì)和常見污染物等會(huì)產(chǎn)生大量的干擾信號(hào)，很難利用吸光率將樣品中的DNA、rRNA和tRNA與mRNA準(zhǔn)確地區(qū)分出來，致測(cè)量結(jié)果誤差較大；而且該方法檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)靈敏度和準(zhǔn)確度不高。

瓊脂糖變性膠檢測(cè)方法是將所分離出的總RNA在瓊脂糖變性凝膠上進(jìn)行電泳，根據(jù)電泳帶的分布和亮度，與對(duì)照進(jìn)行對(duì)比而估算出RNA的質(zhì)量和含量。但這種方法的缺點(diǎn)是：對(duì)樣品量的要求較多，否則影響精度；當(dāng)樣品中的總RNA量＜1mg時(shí)，無法獲得檢測(cè)結(jié)果。

Northern雜交檢測(cè)方法是在瓊脂糖變性膠檢測(cè)方法基礎(chǔ)上的mRNA定量檢測(cè)方法，即將電泳后的RNA轉(zhuǎn)印在尼龍薄膜上，用標(biāo)有放射性同位素³²P的寡聚核苷酸或標(biāo)有生物素的寡核甘酸與印跡中的mRNA雜交，通過與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比雜交產(chǎn)物來確定mRNA的含量。但這一方法的缺點(diǎn)是：仍然缺乏精度，而且耗時(shí)較長(zhǎng)，還具有放射性污染的危險(xiǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種mRNA定量檢測(cè)方法，是一種光學(xué)薄膜生物傳感器芯片檢測(cè)方法，是以Southern雜交(DNA與DNA雜交)技術(shù)和光學(xué)薄膜生物傳感器芯片(生物芯片)技術(shù)為基礎(chǔ)，研制出的可以對(duì)樣品中的mRNA含量進(jìn)行直接定量檢測(cè)的一種新方法。

基本原理是：提取被檢測(cè)樣品的總RNA，然后以mRNA的尾巴poly?A(多聚腺苷酸)為模板，以oligo?dT20(有20個(gè)胸腺嘧啶脫氧核苷酸的寡聚脫氧核苷酸)為引物，用含有DIG-11-dUTP(地高辛標(biāo)記的尿嘧啶脫氧核苷酸)的dNTPs(脫氧核苷酸混合物)，合成cDNA。用oligo?dA20(有20個(gè)腺嘌呤脫氧核苷酸的寡聚脫氧核苷酸)在芯片表面上進(jìn)行探針點(diǎn)樣后，將cDNA與芯片上的探針進(jìn)行雜交，將cDNA上的dT20核苷酸序列與芯片上探針的dA20序列互補(bǔ)結(jié)合，經(jīng)過洗滌，未結(jié)合的多余的cDNA鏈、其它DNA、RNA以及不能完全匹配的核酸都被去除，而完全匹配的cDNA的雜交鏈留在芯片上。然后用anti-DIG-AP(連接了堿性磷酸酶AP的地高辛抗體)與DIG結(jié)合，用NBT/BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸/對(duì)甲苯胺藍(lán))與AP結(jié)合，產(chǎn)生沉淀反應(yīng)，根據(jù)沉淀物在芯片上沉積的厚度不同而使芯片顯現(xiàn)出不同的顏色(從紫紅色到藍(lán)色)，用樣品的mRNA與標(biāo)準(zhǔn)mRNA呈現(xiàn)的顏色進(jìn)行比對(duì)而確定被檢測(cè)樣品中mRNA的含量。

本發(fā)明一種mRNA定量檢測(cè)方法，包括光學(xué)薄膜生物傳感器芯片準(zhǔn)備、探針合成及點(diǎn)陣、標(biāo)準(zhǔn)mRNA色板制備、總RNA提取、cDNA合成及DIG標(biāo)記、雜交、沉淀反應(yīng)及顯色、比色等操作步驟，具體如下：

步驟一、光學(xué)薄膜生物感應(yīng)器芯片準(zhǔn)備；

所述的光學(xué)薄膜生物感應(yīng)器芯片為硅材質(zhì)光學(xué)薄膜生物感應(yīng)器芯片，芯片分為三層，從下到上依次為硅支持層、光反射層、表面附著層。

步驟二、探針合成及點(diǎn)陣；

探針為oligo?dA20，其5′端含有醛基；用移液器或點(diǎn)樣儀，將探針在芯片上進(jìn)行點(diǎn)陣。

步驟三、標(biāo)準(zhǔn)mRNA色版樣品準(zhǔn)備；

標(biāo)準(zhǔn)mRNA為neo?poly(A)″Sense″RNA，濃度為200ug/ml，制作成含量為1ng到500ng共500個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，用以制作標(biāo)準(zhǔn)色版。

步驟四、cDNA合成及DIG標(biāo)記；

用反轉(zhuǎn)錄酶和dNTPs，將標(biāo)準(zhǔn)mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成帶有DIG標(biāo)注的cDNA。

步驟五、雜交；

將cDNA加入雜交緩沖液中，再將芯片置于雜交緩沖液中，在45℃下10分鐘；室溫下用0.1xSSC中清洗3次，吹干待用。

步驟六、沉淀反應(yīng)及顯色；