[發(fā)明專利]一種mRNA定量檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010228695.0
• 申請(qǐng)日: 2010-07-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101887023A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-11-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張耀川;白素蘭
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院
• 主分類號(hào): G01N21/78
• 分類號(hào): G01N21/78;G01N21/31;C12Q1/68
• 代理公司: 北京永創(chuàng)新實(shí)專利事務(wù)所 11121
• 代理人: 周長(zhǎng)琪

1.一種mRNA定量檢測(cè)方法，其特征在于如下步驟：

步驟一、光學(xué)薄膜生物感應(yīng)器芯片準(zhǔn)備；

所述的光學(xué)薄膜生物感應(yīng)器芯片為硅材質(zhì)光學(xué)薄膜生物感應(yīng)器芯片，芯片分為三層，從下到上依次為硅支持層、光反射層、表面附著層；

步驟二、探針合成及點(diǎn)陣；

探針為oligo?dA20，其5′端含有醛基；用移液器或點(diǎn)樣儀，將探針在芯片上進(jìn)行點(diǎn)陣；

步驟三、標(biāo)準(zhǔn)mRNA色版樣品準(zhǔn)備；

標(biāo)準(zhǔn)mRNA為neo?poly(A)″Sense″RNA，濃度為200ug/ml，制作成含量為1ng到500ng共500個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，用以制作標(biāo)準(zhǔn)色版；

步驟四、cDNA合成及DIG標(biāo)記；

用反轉(zhuǎn)錄酶和dNTPs，將標(biāo)準(zhǔn)mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成帶有DIG標(biāo)注的cDNA；

步驟五、雜交；

將cDNA加入雜交緩沖液中，再將芯片置于雜交緩沖液中，在45℃下10分鐘；室溫下用0.1xSSC中清洗3次，吹干待用；

步驟六、沉淀反應(yīng)及顯色；

室溫下將芯片置于雜交緩沖液中，加入anti-DIG-AP，溫育10分鐘；用0.1xSSC沖洗芯片3次，再將芯片置于AP緩沖液中，溫育5分鐘；取出芯片，再將芯片置于100ml的NBT/BCIP中，在室溫條件下，避光溫育5分鐘，用ddH₂O沖洗芯片3次，晾干；

步驟七、將標(biāo)準(zhǔn)mRNA獲得的顏色梯度制作成標(biāo)準(zhǔn)色版，每100ul中，含量從1ngl到500ng，共500個(gè)含量值的標(biāo)準(zhǔn)色塊；

步驟八、定量檢測(cè)；

(a)按照步驟一和步驟二準(zhǔn)備光學(xué)薄膜生物傳感器芯片并進(jìn)行探針合成及點(diǎn)陣；

(b)總RNA提取：將所要檢測(cè)的樣品用Trizol試劑提取總RNA，利用分光光度檢測(cè)方法檢測(cè)樣品中總RNA的含量，用以初步判斷RNA的提取量；

(c)cDNA合成及DIG標(biāo)記：用反轉(zhuǎn)錄酶和dNTPs，將總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成帶有DIG標(biāo)注的cDNA；

(d)按照步驟五和步驟六進(jìn)行雜交、沉淀反應(yīng)及顯色；

(e)比色：將樣品提取總RNA所獲得的樣點(diǎn)顏色與標(biāo)準(zhǔn)色版的樣點(diǎn)顏色進(jìn)行比對(duì)，直接比色觀察或顯微鏡照相后在電腦上比色觀察均可，在標(biāo)準(zhǔn)色版上與檢測(cè)樣點(diǎn)顏色一致的色塊所對(duì)應(yīng)的mRNA含量值就是被檢測(cè)樣品的mRNA含量值。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種mRNA定量檢測(cè)方法，其特征在于：步驟一所述的硅支持層厚度為硅支持層上依次鍍有光反射層和表面附著層；所述的光反射層物質(zhì)為氮化硅，厚度為表面附著層為PPL，厚度為表面富含氨基，用于固定探針。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種mRNA定量檢測(cè)方法，其特征在于：步驟二所述的探針oligodA20是用20個(gè)dATP合成，在其5′端進(jìn)行了醛基修飾，使其5′端含有醛基；步驟二所述的點(diǎn)陣是將探針樣點(diǎn)按矩陣排列方式點(diǎn)在芯片上，由于芯片表面附著層上富含氨基，能與探針上所帶的醛基共價(jià)結(jié)合，從而將探針固定在表面附著層上；在芯片上的探針樣點(diǎn)重復(fù)數(shù)根據(jù)需要設(shè)計(jì)，探針濃度為1uM，點(diǎn)樣量為每點(diǎn)200nl。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種mRNA定量檢測(cè)方法，其特征在于：步驟八(b)中所述的總RNA提取，總RNA中含有mRNA，提取后要用分光光度檢測(cè)方法檢測(cè)樣品中總RNA的含量，用以初步判斷RNA的提取量。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種mRNA定量檢測(cè)方法，其特征在于：步驟四所述的反轉(zhuǎn)錄酶為RevertAid?M-MULV?Rrverse?Transcriptase；步驟四所述的dNTPs含dATP、dCTP、dGTP各1mM，dTTP?0.65mM，DIG-11-dUTP?0.35mM。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種mRNA定量檢測(cè)方法，其特征在于：步驟五所述的雜交為Southern雜交，使得帶DIG標(biāo)記的cDNA與傳感器芯片上的探針互補(bǔ)結(jié)合；步驟五所述的雜交緩沖液含5xSSC、5mg/ml酸處理的干酪素ATC。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種mRNA定量檢測(cè)方法，其特征在于：步驟六所述的anti-DIG-AP為帶有堿性磷酸酶AP的DIG抗體；步驟六所述的AP緩沖液含100mM的Tris-HCl、100mM的NaCl、50mM的MgCl，pH值為9.5；步驟六所述的沉淀反應(yīng)和顯色為NBT/BCIP與DIG抗體上的AP結(jié)合，由于芯片上沉淀物改變了芯片表面厚度而顯出不同的顏色。