[發明專利]柯薩奇病毒實時熒光RT-PCR檢測方法和試劑盒無效

申請號：	201010222095.3	申請日：	2010-07-07
公開（公告）號：	CN102312017A	公開（公告）日：	2012-01-11
發明（設計）人：	李想;潘良文;李俊毅;黃一;盧鐘山;張舒亞;呂蓉	申請（專利權）人：	上海出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗檢疫技術中心
主分類號：	C12Q1/70	分類號：	C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
代理公司：	上海專利商標事務所有限公司 31100	代理人：	徐迅
地址：	200135 上***	國省代碼：	上海;31
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摘要：
搜索關鍵詞：	柯薩奇病毒實時熒光 rt pcr 檢測方法試劑盒
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及分子生物學和核酸檢測技術領域。具體地，本發明涉及針對柯薩奇病毒檢測的實時熒光RT-PCR檢測方法和試劑盒。

背景技術

柯薩奇病毒(Coxsackievirus)屬于微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)腸道病毒屬，據其生物學特點分為兩類，即A組和B組。人類感染柯薩奇病毒后分別引起皰疹性咽峽炎(A組)和非麻痹性類脊髓灰質炎(B組)。據調查伴有口咽部皰疹和皮疹的急性熱病中，79％為柯薩克病毒A組所致，其中較常見的柯薩奇病毒A16型是引起手足口病的主要病原體之一。柯薩奇病毒B組是引發人類病毒性心肌炎的主要病原微生物^[1]。

近年來，在北京、河南、沈陽等地先后發生多起柯薩奇病毒感染事件^[2-4]。2005年5月河南發生一起柯薩奇病毒B5型疫情，歷時34天發病49例，14歲以下兒童罹患率達13.57％^[2]。2006年我國衛生部門統計，全國各地共報告手足口病達13637例^[4]，有相當一部分病例是感染A16型柯薩奇病毒所致。

目前尚未研制出有效預防柯薩奇病毒的疫苗，因此加強柯薩奇病毒防控工作尤為重要。為了及時有效地發現病毒感染源，建立高效的柯薩奇病毒檢測方法是預防病毒感染和流行的關鍵技術手段之一。

然而，目前在柯薩奇病毒檢測中存在諸多難點。環境樣品中病毒含量非常低，一般在100個病毒顆粒以下，且干擾和抑制后續檢測的因子更加復雜，給檢測方法帶來了巨大挑戰，因此需要針對性更強和靈敏度更高的檢測方法。國內外研究者近幾年相繼報道了柯薩奇病毒的ELISA方法、普通PCR和實時熒光PCR等方法^[5-8]。雖然ELISA方法能檢測早期病人血清中柯薩奇病毒的IgM和IgG抗體，但該法因抗體制備困難、檢測靈敏度不高使應用受到限制。

基于核酸的PCR檢測技術成本低且快速，已廣泛應用于病毒檢測。前人的研究多基于Taqman-FAM-TAMRA探針，例如：Tana(2008)等建立柯薩奇病毒A16型與腸道病毒71型的多重實時熒光PCR方法^[5]，然而，該方法檢測A16型病毒時采用的是熒光雜交探針，其對實時熒光PCR系統有了更高的要求，不是所有實時熒光PCR儀均可實施反應。熒光雜交探針需要2條相鄰的探針，這樣增加了成本，并且其中一條探針標記了LC?Red?750熒光基團，該基團分辨率有限，靈敏度差。因此，該方法不利于推廣應用。

本領域尚缺乏針對單一血清型柯薩奇病毒的高靈敏度、高特異性、靈活簡便、應用性強的檢測方法，更缺乏快速檢測和鑒定各種血清型柯薩奇病毒的檢測技術。

綜上所述，鑒于目前尚沒有特異性好、靈敏度高的柯薩奇病毒實時熒光RT-PCR檢測方法。因此，本領域迫切需要開發特異性好、靈敏度高的柯薩奇病毒實時熒光RT-PCR檢測方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種特異性好、靈敏度高、準確、簡便的柯薩奇病毒實時熒光RT-PCR檢測方法。

本發明的另一目的在于提供柯薩奇病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒。

本發明的再一目的在于提供柯薩奇病毒檢測相關引物和探針。

在本發明的第一方面，提供了一種聚合酶鏈式反應方法，它包括步驟：在聚合酶反應體系中進行聚合酶鏈式反應，所述的反應體系中含有擴增柯薩奇病毒的特異性引物對和柯薩奇病毒特異性探針，并且所述引物擴增出的擴增產物具有柯薩奇病毒基因組VP1區的核苷酸序列。

在另一優選例中，所述的擴增柯薩奇病毒的特異性引物對包括選自下組的1-5種引物對：

A9型柯薩奇病毒：SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2；

A16型柯薩奇病毒：SEQ?ID?NO：4和SEQ?ID?NO：5；

B2型柯薩奇病毒：SEQ?ID?NO：7和SEQ?ID?NO：8；

B3型柯薩奇病毒：SEQ?ID?NO：10和SEQ?ID?NO：11；