[發(fā)明專利]一種表達PXR-MRP2熒光報告基因技術(shù)平臺高通量藥物篩選方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010221632.2
• 申請日: 2010-07-06
• 公開（公告）號: CN101906469A
• 公開（公告）日: 2010-12-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 高利臣;曹杉;俞競;范嵐;李智;王連生;張偉;劉昭前;周宏灝
• 申請（專利權(quán)）人: 中南大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/66
• 代理公司: 張家界市慧誠商標(biāo)專利事務(wù)所 43209
• 代理人: 高紅旺

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和藥理學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種在HepG2細(xì)胞內(nèi)表達孕烷X受體(pregnane?X?receptor，PXR)及藥物轉(zhuǎn)運體—有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽(multidrug?resistance-associated?protein，MRP2)和海腎熒光素酶內(nèi)參報告基因技術(shù)平臺，利用該技術(shù)平臺篩選能夠通過激動PXR來對靶基因—藥物轉(zhuǎn)運體MRP2產(chǎn)生誘導(dǎo)的可能活性藥物配體，用于新藥篩選的方法。

背景技術(shù)

新藥的研發(fā)是一個高投入、高風(fēng)險，同時也是高收益的產(chǎn)業(yè)。在美國食品藥品監(jiān)督管理局FDA往往需要科研工作團隊花上10幾年的時間，數(shù)億美元的支出才能使一種新藥最終上市。期間在臨床前的實驗室研究階段對可能活性藥物的初步藥效學(xué)及一般毒理學(xué)研究以及臨床研究階段的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期研究都有很多不確定因素，使得研發(fā)的新藥大部分中途夭折，從而浪費了大量人力及物力成本。因此，對可能活性先導(dǎo)藥物的高通量篩選以及有效甄別能否最終實現(xiàn)該藥物的臨床應(yīng)用方法成為藥學(xué)及醫(yī)學(xué)工作者研究的熱點。制約一個新藥能否上市有三個最主要因素，即：是否“安全、有效、可控”。一個研發(fā)中的新藥或者已經(jīng)上市的藥物，即使其療效突出，質(zhì)量可控，如果產(chǎn)生了嚴(yán)重不良反應(yīng)都會被禁止研發(fā)和銷售。因此，以新藥臨床研究階段藥物代謝動力學(xué)特征為靶標(biāo)高通量篩選可能候選藥物被醫(yī)藥界認(rèn)為是新藥高通量篩選研究的新領(lǐng)域。

多藥耐藥相關(guān)蛋白MRP2是表達在膽小管膜上的藥物外排ATP結(jié)合盒式蛋白超家族轉(zhuǎn)運體，是外來信號核受體PXR的靶基因。MRP2被認(rèn)為與藥物不良反應(yīng)和不可預(yù)期的藥物—藥物相互作用藥物代謝動力學(xué)特征相關(guān)。有證據(jù)證實ATP結(jié)合盒式蛋白超家族在臨床藥物處置過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。特別是肝內(nèi)特異性表達著大量的MRP2可以轉(zhuǎn)運很多底物藥物：抗癌類阿霉素、依托泊苷、米托蒽醌、順鉑、長春新堿、長春堿、喜樹堿，HIV治療藥物類茚地那韋、拉米夫定、沙奎那韋、阿德福韋、西多福韋、奈非那韋，他汀類藥物普伐他汀，內(nèi)源性物質(zhì)有膽汁酸、膽紅素、白三烯、雌二醇、谷胱甘肽等。表達或功能底下的MRP2引起血漿中膽汁酸、膽紅素及血漿結(jié)合他汀類藥物增多，從而產(chǎn)生膽汁淤積及黃疸性疾病和藥源性橫紋肌溶解癥。同時，PXR是通過與MRP2啟動子區(qū)特異性序列結(jié)合來誘導(dǎo)其表達，而一些可能的活性先導(dǎo)藥物恰恰是PXR的配體。因此，找到誘導(dǎo)PXR調(diào)節(jié)MRP2表達的可能活性先導(dǎo)藥物，就可以有效治療膽汁淤積、黃疸性疾病以及由于底物藥物累積所引起的藥源性不良反應(yīng)疾病。運用可能的活性先導(dǎo)藥物處理表達PXR和含有MRP2啟動子區(qū)結(jié)合序列的海腎熒光素酶內(nèi)參報告基因瞬時轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞，就可以在自發(fā)光檢測儀上檢測熒光素酶活性，以螢火蟲熒光與海腎熒光的比值反映不同的可能活性先導(dǎo)藥物對MRP2藥物轉(zhuǎn)運體啟動子活性的影響。最終實現(xiàn)運用熒光報告基因的方法高通量篩選對PXR有誘導(dǎo)作用調(diào)節(jié)MRP2表達的可能活性先導(dǎo)藥物。這一篩選途徑在最終尋找到有效治療膽汁淤積、黃疸性疾病、藥源性橫紋肌溶解癥新的活性藥物方面具有重要意義。也可以規(guī)避一些其它藥物篩選方法所得到的藥物因最終臨床用藥過程產(chǎn)生的藥物—藥物相互作用所引起的嚴(yán)重毒性，并降低合并用藥的藥物不良反應(yīng)。

有研究為了找到治療氧化應(yīng)激引起的心機損傷的藥物，把在氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡通路中起著至關(guān)重要的p66^shc基因啟動子片段克隆到熒光素酶報告基因的上游，獲得了p66^shc基因啟動子控制的熒光素酶報告基因表達質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)染人的肺癌細(xì)胞A549，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系A(chǔ)549/p66^shc。并利用報告基因篩選系統(tǒng)，篩選了數(shù)百種中藥提取物及單體化合物，找到了2種中藥提取物和8種單體化合物。

也有研究為了找到治療心血管糖尿病的藥物，建立了以類法尼醇X受體(Farnesoid?X?receptor，F(xiàn)XR)為靶點的FXR激動劑高通量篩選模型。就是從肝細(xì)胞擴增出FXR配體活化結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ligand?bingding?domain，LBD)基因序列，并構(gòu)建了融合表達載體pBind-FXR和報告載體pG13-GAL4。通過表達質(zhì)粒和報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，瞬時轉(zhuǎn)染L102細(xì)胞，通過測定報告基因熒光素酶的表達，對880個真菌及放線菌的次生代謝產(chǎn)物和120個純化樣品進行了FXR的激動劑篩選，得到了CoQ10和F01WA2076A兩個活性化合物。