[發明專利]一種表達PXR-MRP2熒光報告基因技術平臺高通量藥物篩選方法

無效

• 申請號: 201010221632.2
• 申請日: 2010-07-06
• 公開（公告）號: CN101906469A
• 公開（公告）日: 2010-12-08
• 發明（設計）人: 高利臣;曹杉;俞競;范嵐;李智;王連生;張偉;劉昭前;周宏灝
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/66
• 代理公司: 張家界市慧誠商標專利事務所 43209
• 代理人: 高紅旺

1.一種表達PXR-MRP2熒光報告基因技術平臺高通量藥物篩選方法，其特征在于：該方法直接從新藥研究的末端藥物臨床研究階段的藥物代謝動力學靶標入手篩選候選可能活性先導藥物，構建含MRP2基因啟動子序列熒光素酶報告基因及PXR的表達質粒，瞬時轉染HepG2細胞；通過在自發光檢測儀上檢測熒光素酶活性，以螢光蟲熒光與海腎熒光的比值分別反映不同可能活性先導藥物對MRP2啟動子活性的影響，進行體外PXR誘導可能活性先導藥物的高通量篩選。

2.根據權利要求1所述的表達PXR-MRP2熒光報告基因技術平臺高通量藥物篩選方法，其特征在于：所述構建含MRP2基因啟動子序列熒光素酶報告基因及PXR的表達質粒，瞬時轉染HepG2細胞的步驟如下：

步驟一：MRP2基因啟動子序列熒光素酶報告基因質粒的構建，過程是：

(1)血樣采集和DNA抽提；

采集健康志愿者外周靜脈血5mL，置于EDTA抗凝的玻璃試管，貯存于-40℃冰箱備用；

(2)DNA抽提方法；

按照標準苯酚-氯仿法抽提基因組DNA，置于4℃冰箱備用；

(3)MRP2?promoter?PCR；

(4)擴增產物回收；

(5)把MRP2的PCR產物連接在pGEM-T載體上，提取質粒，酶切和測序；

(6)將測序證實插入片段無PCR錯配的質粒DNA和PGL4.17載體用內切酶雙酶切，用瓊脂糖電泳分別回收插入片段及載體，使用凝膠塊快速鏈接；轉化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆抽提質粒，酶切和測序；

(7)重組克隆進一步培養擴增；

步驟二：PXR?cDNA表達質粒的構建，過程是：

(1)RNA抽提和逆轉錄；

用Trzol從原代培養的肝細胞中提取總RNA，用RevertAid^TM?First?Strand?cDNA合成試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增；

(2)PXR?PCR；

(3)把PXR的PCR產物連在pPEM-T載體上和測序；

(4)將測序證實插入片段無PCR錯配的質粒DNA和pcDNA3.1/hisB(-)載體用HindⅢ和EcoRⅠ同時雙酶切，用瓊脂糖電泳分別回收插入片段及載體，使用凝膠塊快速鏈接；轉化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆抽提質粒，酶切鑒定；

(5)重組克隆進一步培養擴增，抽提質粒DNA；質粒DNA保存在70％乙醇中保持無菌狀態，-20℃凍存待用；

步驟三：MRP2報告基因質粒和PXR?cDNA表達質粒的鑒定，過程是：

(1)MRP2和PXR分別雙酶切；

(2)1％瓊脂糖凝膠電泳；

(3)測序分析；

步驟四：用報告基因質粒，pRL-TK(內對照質粒)和pcDNA3.1/hisB(-)-PXR瞬時轉染HepG2細胞，過程是：用質粒中量提取試劑盒純化質粒DNA，把熒光報告基因質粒，pRL-TK，PXR和對照質粒根據Lipofectamine2000說明轉染HepG2細胞；每次實驗中均包含下列樣品組，以另一報告基因載體pRL-TK作為內對照與PXR表達質粒和各待測的熒光報告基因載體進行共轉染，通過測定其基因產物Renilla?Luciferas的活性，校正各孔間的轉染效率。

3.根據權利要求1或2所述的表達PXR-MRP2熒光報告基因技術平臺高通量藥物篩選方法，其特征在于：所述體外PXR誘導可能活性先導藥物的高通量篩選步驟如下：

步驟一：培養HepG2細胞；

步驟二：HepG2細胞以每孔2×10⁵個細胞的密度用不含胎牛血清和抗生素的DMEM培養基接種于24孔培養板；每孔分別轉入600ng?MRP2報告基因質粒或對照質粒，100ngPXR質粒和10ng?pRL-TK。用適量不含抗生素和胎牛血清的培養液分別稀釋DNA和Lipofectamine2000脂質體后，將二者混合，室溫放置20min，加入培養板孔中，輕輕晃動孔板使均勻；6h后，換新鮮含10％小牛血清的DMEM，加入DMSO、陽性藥物和各種不同濃度的候選可能活性藥物，孵育24h；

步驟三：孵育24h后，將生長培養基從待檢細胞吸出；

步驟四：用1×PBS漂洗細胞，不要接觸貼壁細胞，盡可能多地將漂洗用PBS吸出；

步驟五：向細胞培養孔中加入適量1×被動裂解緩沖液(PLB)；

步驟六：報告基因的活性檢測及分析；

報告基因活性檢測的過程是：

(1)轉染后孵育24h，將生長培養基從待檢細胞吸出；

(2)用1×PBS漂洗細胞，不要接觸貼壁細胞，盡可能多地將漂洗用PBS吸出；

(3)向細胞培養孔中加入適量1×被動裂解緩沖液(PLB)；

(4)檢測熒光素酶活性：細胞裂解后用雙熒光報告基因試劑盒在在發光檢測儀上檢測熒光素酶活性，以螢火蟲熒光與海腎熒光的比值分別反映不同藥物對MRP2啟動子活性的影響。