[發明專利]黑素細胞生物活性檢測及個體化培養方法

有效

• 申請號: 201010217291.1
• 申請日: 2010-07-05
• 公開（公告）號: CN101892286A
• 公開（公告）日: 2010-11-24
• 發明（設計）人: 許愛娥;洪為松;傅麗芳;尉曉冬
• 申請（專利權）人: 許愛娥;洪為松;傅麗芳
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12N5/071;G01N21/31
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

(一)技術領域

本發明提供了一種黑素細胞生物活性檢測方法及個體化培養方法。

(二)背景技術

隨著黑素細胞培養技術的日益成熟，使用培養的自體黑素細胞移植成為目前白癜風治療的研究和發展方向之一。移植的純黑素細胞能為白癜風區域提供新的黑素細胞來源，通過增殖擴散，使白斑區復色。用培養的黑素細胞作移植最大技術難點在于黑素細胞生長較差，無法在短期內大量擴增。

移植的黑素細胞生物學活性對療效有著極其重要的作用，挑選選生物學活性好的黑素細胞進行移植可明顯提高療效，目前還沒有對移植的自體黑素細胞生物學活性進行檢測的研究報道。

(三)發明內容

本發明目的是提供一種黑素細胞生物活性檢測方法及利用該檢測方法對黑素細胞個體化培養的方法。

本發明采用的技術方案是：

黑素細胞生物活性檢測方法，所述方法包括：取分離自白癜風患者表皮細胞的黑素細胞，進行傳代培養，傳代培養過程中進行下述參數評測：

(1)黑素細胞分裂時間DOT計算：每次接種和傳代時計數黑素細胞數量，計算獲得傳代時細胞生長倍數P，根據細胞生長倍數P和生長時間T，按公式計算細胞黑素分裂時間DOT＝0.3T/logP，單位為日；

(2)黑素含量M計算：用二甲基亞砜溶解已知濃度的黑色素，在分光度計475nm處測吸光度A₀，以黑色素含量為橫坐標、以對應吸光度值為縱坐標制作標準曲線；在黑素細胞接種和傳代時，收集定量黑素細胞離心，加入1mol/l?NaOH在37℃水浴溶解細胞30分鐘后，在分光度計475nm處測細胞吸光度A，根據標準曲線計算獲得每個細胞的黑素含量M，單位ng/cell；

(3)黑素制造量MP計算：MP＝(M₂×P-M₁)/1.3D(P-1)，其中：MP為黑素細胞制造量，單位ng/cell/24hr；M₁為接種時細胞黑素含量，單位ng/cell；M₂為傳代時細胞黑素含量，單位ng/cell；P為細胞增長倍數；D為細胞分裂時間DOT，單位日；

(4)結果判斷：若傳代細胞的DOT值＜4.5，且M、MP數值穩定(M：0.15～0.30ng/cell，MP＜0.10ng/cell/24hour)，則判定該傳代細胞處于開始或生長階段，適宜進行自體黑素細胞移植。

自體黑素細胞懸液移植治療穩定期白癜風是一種有效的手術方法，接種的細胞濃度為60000～100000/cm²，根據移植面積計算需要細胞量，所以一般要求第三代以后的黑素細胞才能滿足移植要求。黑素細胞的生長過程包括開始、生長和衰老三個階段，移植的黑素細胞要求處在開始或生長階段。衰老的細胞活性差，在患者移植區不易生長和分化，所以判斷移植的黑素細胞的生長階段很重要。黑素細胞在生長的開始階段過程中細胞生長快速，黑素含量降低；生長階段細胞生長快速，黑素含量及黑素制造量維持恒定；衰老階段細胞生長緩慢，黑素含量和黑素制造量升高。本發明對白癜風患者黑素細胞分裂時間、黑素含量和黑素制造量進行檢測分析，從而判斷細胞的生長階段，為移植選擇黑素細胞提供了實驗依據。

細胞的分裂時間(DOT)是指連續分裂的細胞從第一次完成分裂開始到下一次完成分裂為止所經過的時間，黑素細胞DOT小，表明黑素細胞的分裂和增殖能力強，細胞的生物學活性好，此類細胞移植到患者皮損處的成活率就相對較高，療效就好。

本發明還涉及一種黑素細胞個體化培養方法，所述方法包括：

(一)取分離自白癜風患者表皮細胞的黑素細胞，于Hu16培養基中進行傳代培養，傳代培養過程中進行下述參數評測：

1)黑素細胞分裂時間DOT計算：每次接種和傳代時計數黑素細胞數量，計算獲得傳代時細胞生長倍數P，根據細胞生長倍數P和生長時間T，按公式計算細胞黑素分裂時間DOT＝0.3T/logP，單位為日；

2)黑素含量M計算：用二甲基亞砜溶解已知濃度的黑色素，在分光度計475nm處測吸光度A₀，以黑色素含量為橫坐標、以對應吸光度值為縱坐標制作標準曲線；在黑素細胞接種和傳代時，收集定量黑素細胞離心，加入1mol/l?NaOH在37℃水浴溶解細胞30分鐘后，在分光度計475nm處測細胞吸光度A，根據標準曲線計算獲得每個細胞的黑素含量M，單位ng/cell；