[發明專利]黑素細胞生物活性檢測及個體化培養方法

有效

• 申請號: 201010217291.1
• 申請日: 2010-07-05
• 公開（公告）號: CN101892286A
• 公開（公告）日: 2010-11-24
• 發明（設計）人: 許愛娥;洪為松;傅麗芳;尉曉冬
• 申請（專利權）人: 許愛娥;洪為松;傅麗芳
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12N5/071;G01N21/31
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

1.黑素細胞生物活性檢測方法，所述方法包括：取分離自白癜風患者表皮細胞的黑素細胞，進行傳代培養，傳代培養過程中進行下述參數評測：

(1)黑素細胞分裂時間DOT計算：每次接種和傳代時計數黑素細胞數量，計算獲得傳代時細胞生長倍數P，根據細胞生長倍數P和生長時間T，按公式計算細胞黑素分裂時間DOT＝0.3T/logP，單位為日；

(2)黑素含量M計算：用二甲基亞砜溶解已知濃度的黑色素，在分光度計475nm處測吸光度A₀，以黑色素含量為橫坐標、以對應吸光度值為縱坐標制作標準曲線；在黑素細胞接種和傳代時，收集定量黑素細胞離心，加入1mol/l?NaOH在37℃水浴溶解細胞30分鐘后，在分光度計475nm處測細胞吸光度A，根據標準曲線計算獲得每個細胞的黑素含量M，單位ng/cell；

(3)黑素制造量MP計算：MP＝(M₂×P-M₁)/1.3D(P-1)，其中：MP為黑素細胞制造量，單位ng/cell/24hr；M₁為接種時細胞黑素含量，單位ng/cell；M₂為傳代時細胞黑素含量，單位ng/cell；P為細胞增長倍數；D為細胞分裂時間DOT，單位日；

(4)結果判斷：若傳代細胞的DOT值＜4.5，且M、MP滿足：0.15＜M＜0.30，MP＜0.10，則判定該傳代細胞處于開始或生長階段，適宜進行自體黑素細胞移植。

2.一種黑素細胞個體化培養方法，所述方法包括：

(一)取分離自白癜風患者表皮細胞的黑素細胞，于Hu16培養基中進行傳代培養，傳代培養過程中進行下述參數評測：

(1)黑素細胞分裂時間DOT計算：每次接種和傳代時計數黑素細胞數量，計算獲得傳代時細胞生長倍數P，根據細胞生長倍數P和生長時間T，按公式計算細胞黑素分裂時間DOT＝0.3T/logP，單位為日；

(2)黑素含量M計算：用二甲基亞砜溶解已知濃度的黑色素，在分光度計475nm處測吸光度A₀，以黑色素含量為橫坐標、以對應吸光度值為縱坐標制作標準曲線；在黑素細胞接種和傳代時，收集定量黑素細胞離心，加入1mol/l?NaOH在37℃水浴溶解細胞30分鐘后，在分光度計475nm處測細胞吸光度A，根據標準曲線計算獲得每個細胞的黑素含量M，單位ng/cell；

(3)黑素制造量MP計算：MP＝(M₂×P-M₁)/1.3D(P-1)，其中：MP為黑素細胞制造量，單位ng/cell/24hr；M₁為接種時細胞黑素含量，單位ng/cell；M₂為傳代時細胞黑素含量，單位ng/cell；P為細胞增長倍數；D為細胞分裂時間DOT，單位日；

所述Hu16培養基終濃度組成如下：

bFGF?25ng/ml，CT?10ng/ml，IBMX?20ug/ml，胎牛血清10％，溶劑為F12基礎培養基；

(二)根據傳代細胞各參數評測結果，對培養基組分進行調整：

1)、若傳代細胞的DOT值＞3.5，M值降低至M＜0.15，細胞的樹突無變化，則將Hu16培養基中胎牛血清濃度增加到15％～20％；

2)、若傳代細胞的DOT值＞3.5，M值升高至M＞0.3，細胞的樹突無變化，則將Hu16培養基中bFGF濃度增加到40～80ng/ml；

3)、若傳代細胞的DOT值＞3.5，且細胞的樹突減少至＜3，則將Hu16培養基中的IBMX濃度增加到30～60ug/ml、CT濃度增加到20～40ng/ml。