[發(fā)明專利]染色體的無痕跡修飾方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010213287.8
• 申請日: 2010-06-30
• 公開（公告）號: CN101892221A
• 公開（公告）日: 2010-11-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王德明
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州神洲基因有限公司
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N1/21
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責任公司 32102
• 代理人: 陳忠輝

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及采用基因重組手段對染色體上一個或多個靶基因進行插入、敲除或置換的方法，尤其是一種不會給原染色體留下任何篩選標記或者外源DNA序列的無痕跡修飾方法，屬于染色體基因組改造技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

染色體基因組改造技術(shù)，例如：基因干擾、外源基因插入、基因突變等技術(shù)，對于生物能源、代謝工程和農(nóng)業(yè)工程領(lǐng)域非常重要。Red/ET重組工程(Recombineering)是近年來建立的一種新型遺傳工程技術(shù)，它是通過噬菌體產(chǎn)生的重組蛋白(Exo、Beta、Gam)介導(dǎo)的高效率的體內(nèi)同源重組反應(yīng)，對目的DNA序列進行基因插入、敲除、替換等操作，不需要選擇合適的限制性內(nèi)切位點。

真核細胞和一些細菌的基因重組工程中的瓶頸之一是存在高頻率的非同源重組和低效率的同源重組，因而需要大量篩選以便分離出所需的突變基因，這種方法在緩慢生長的細菌如mycobacteria中不起作用，因為同源重組與非同源重組相比頻率要低得多。

為了避免大容量地篩選重組基因，一般需要在轉(zhuǎn)運盒中包含篩選標記以利于確認靶點基因區(qū)的敲入或敲除。然而，插入的篩選標記會影響基因組的進一步改造。為了防止基因組改造后的染色體帶有殘余篩選標記(例如：抗生素抗性基因)或者外源DNA序列(例如FRT或loxP位點)，目前常用的方法是利用Flp重組酶靶點(FRP)或Cre重組酶靶點(loxP)介導(dǎo)的位點特異性，從而達到準確剪切篩選標記的目的。然而，以上方法有各自的特點和缺陷。其一，在篩選標記剪切后仍然存在至少一個FRT位點或loxP位點，即所謂的殘留痕跡；其二，即使在重組酶不存在的情況下，含有多個殘留痕跡的染色體由于痕跡點之間的重組現(xiàn)象，容易導(dǎo)致染色體基因組的隨意重排或敲除。因此，迫切需要一種能夠改造靶基因或基因組序而沒有留下篩選標記或外源DNA序列等殘留痕跡的方法。

對此，目前常用的一種方法是在遞換盒中建立一個反篩選標記，這樣，那些喪失了外源序列的反篩選克隆由于會產(chǎn)生顯性致死效應(yīng)而被確認。例如，在streptomycetes，glkA基因可作為反篩選標記基因。含有葡萄糖類似物2-脫氧葡萄糖的培養(yǎng)基能導(dǎo)致菌株內(nèi)的傳遞盒丟失，這對glkA+菌株具有致死作用。與此相似，在Saccharomyces?cerevisiae可以使用ura?3基因進行陽性和陰性篩選。在尿嘧啶缺乏的培養(yǎng)基中篩選野生型，在包含5-氟乳清酸(5-FOA)培養(yǎng)基中篩選營養(yǎng)缺陷型，因為5-FOA是尿嘧啶前體的類似物并且可以轉(zhuǎn)化為氟尿嘧啶(酵母的一種強抑制劑)，野生型在5-氟乳清酸培養(yǎng)基不能生長。

上述方法存在明顯的缺陷，它們牽涉到兩次交換過程，在最后的重組步驟中沒有陽性篩選，而且局限于glkA或者pyrF無效突變菌株中起作用。另外，每一個敲除步驟需重復(fù)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和敲除，耗時而且勞動強度大。因此，需要一種新的基因組整合(或敲除)方法，要求所有的步驟具有選擇性能，尤其是在最終的重組過程中；而且，宿主基因組的唯一改變是插入或敲除理想基因，不會留下任何篩選標記或殘留痕跡)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，提供一種染色體的無痕跡修飾方法。

本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：染色體的無痕跡修飾方法，首先，構(gòu)建包含陽性篩選標記、反篩選標記、內(nèi)切核酸酶I-SceI、誘導(dǎo)性啟動子、I-SceI識別位點、與靶染色體核酸序列同源的靶核酸置換序列的重組盒；然后，用電轉(zhuǎn)化的方法把上述DNA片段輸入包含重組質(zhì)粒的宿主；接著，通過I-SceI介導(dǎo)的雙鏈斷裂修復(fù)現(xiàn)象從所希望的重組體中敲除以下基因序列：陽性篩選標記、可誘導(dǎo)啟動子、I-Scel基因、反篩選標記；最后，在蔗糖培養(yǎng)基上篩選最終重組體。所述重組盒轉(zhuǎn)化的是Escherichia?coli。

進一步地，上述的染色體的無痕跡修飾方法，對靶染色體的修飾包括：一次或多次地“插入一個或多個核苷酸到靶細胞基因組”或“從靶細胞基因組中敲除一個或多個核苷酸”或“置換靶細胞基因組中一個或者多個核苷酸”，所述靶細胞基因組系指內(nèi)源基因、內(nèi)源基因間的核酸序列或非基因核酸序列。

更進一步地，上述的染色體的無痕跡修飾方法，按以下步驟修飾微生物特定染色體區(qū)：

1)準備一個線性DNA片段，包含與λ-red重組有關(guān)的可以導(dǎo)入靶向微生物的同源臂B和C，陽性篩選標記，反篩選標記，I-SceI基因，I-SceI識別位點，與同源重組敲除篩選標記有關(guān)的可誘導(dǎo)啟動子、同源片段A；

2)導(dǎo)入線性DNA片段到含有權(quán)利要求1所述重組盒的微生物，通過λ-Red重組置換位于DNA片段同源臂和與同源臂同源的染色體之間的特定位點；