[發(fā)明專利]染色體的無痕跡修飾方法

無效

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• 申請日: 2010-06-30
• 公開（公告）號: CN101892221A
• 公開（公告）日: 2010-11-24
• 發(fā)明（設計）人: 王德明
• 申請（專利權）人: 蘇州神洲基因有限公司
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N1/21
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責任公司 32102
• 代理人: 陳忠輝

1.染色體的無痕跡修飾方法，其特征在于：首先，構建包含陽性篩選標記、反篩選標記、內切核酸酶I-SceI、誘導性啟動子、I-SceI識別位點、與靶染色體核酸序列同源的靶核酸置換序列的重組盒；然后，用電轉化的方法把上述DNA片段輸入包含重組質粒的宿主；接著，通過I-SceI介導的雙鏈斷裂修復現(xiàn)象從所希望的重組體中敲除以下基因序列：陽性篩選標記、可誘導啟動子、I-Scel基因、反篩選標記；最后，在蔗糖培養(yǎng)基上篩選最終重組體。

2.根據(jù)權利要求1所述的染色體的無痕跡修飾方法，其特征在于：所述重組盒轉化的是Escherichia?coli。

3.根據(jù)權利要求1所述的染色體的無痕跡修飾方法，其特征在于：按以下步驟修飾微生物特定染色體區(qū)，

1)準備一個線性DNA片段，包含與λ-red重組有關的可以導入靶向微生物的同源臂B和C，陽性篩選標記，反篩選標記，I-SceI基因，I-SceI識別位點，與同源重組敲除篩選標記有關的可誘導啟動子、同源片段A；

2)導入線性DNA片段到含有權利要求1所述重組盒的微生物，通過λ-Red重組置換位于DNA片段同源臂和與同源臂同源的染色體之間的特定位點；

3)在誘導I-SceI內切核酸酶表達的條件培養(yǎng)基中，培養(yǎng)特定染色體位點置換的微生物，導致雙鏈斷裂，位于同源片段A和與片段A同源的染色體區(qū)之間的同源重組用于敲除篩選性標記，其中同源臂B與染色體的敲除靶點一端的50-500bp同源，同源臂C與另一端的50-500bp同源，同源片段A是連接與同源臂B和同源臂C同源的染色體區(qū)的一端300-500bp的區(qū)域。

4.根據(jù)權利要求3所述的染色體的無痕跡修飾方法，其特征在于：所述步驟1)和步驟2)重復多次，準備多個不同的線性DNA片段，以修飾微生物的一系列特定染色體區(qū)。

5.根據(jù)權利要求3所述的染色體的無痕跡修飾方法，其特征在于：所述篩選標記包括陽性篩選標記和陰性篩選標記。

6.根據(jù)權利要求5所述的染色體的無痕跡修飾方法，其特征在于：所述陽性篩選標記是從包含可視的檢測標記中篩選的，允許重組體在缺乏營養(yǎng)源的培養(yǎng)基中生長，賦予重組體對某種化合物產(chǎn)生抗性。

7.根據(jù)權利要求5所述的染色體的無痕跡修飾方法，其特征在于：所述陰性篩選標記是一種在底物存在下對細胞有致死作用的標記。

8.根據(jù)權利要求3所述的染色體的無痕跡修飾方法，其特征在于：所述篩選底物包括基本培養(yǎng)基，缺乏對一個或者多個靶細胞或抗生素必需的一種或多種營養(yǎng)源。

9.根據(jù)權利要求1所述的染色體的無痕跡修飾方法，其特征在于：對靶染色體的修飾包括一次或多次地“插入一個或多個核苷酸到靶細胞基因組”或“從靶細胞基因組中敲除一個或多個核苷酸”或“置換靶細胞基因組中一個或者多個核苷酸”。

10.根據(jù)權利要求9所述的染色體的無痕跡修飾方法，其特征在于：所述靶細胞基因組系指內源基因、內源基因間的核酸序列或非基因核酸序列。