[發明專利]長雙歧桿菌粘附抑制蛋白Aip在防治腹瀉中的應用

有效

• 申請號: 201010212682.4
• 申請日: 2010-06-29
• 公開（公告）號: CN101884782A
• 公開（公告）日: 2010-11-17
• 發明（設計）人: 魏華;徐鋒;彭珍;譚強來;徐迪;萬翠香;熊勇華
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: A61K38/16
• 分類號: A61K38/16;C12P21/00;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/18;C07K1/16;A61P1/12;C12R1/01
• 代理公司: 南昌洪達專利事務所 36111
• 代理人: 劉凌峰

技術領域

本發明涉及一種長雙歧桿菌的應用，尤其涉及一種長雙歧桿菌粘附抑制蛋白Aip在防治腹瀉中的應用。

背景技術

人類胃腸道寄居的400余種腸內菌群，這些微生物菌群通過群體感應來保持相對數量，相互競爭營養和空間，發揮其生理功能。近年來，食源性致病菌(單核增生李斯特菌、大腸桿菌O157等)引起的疾病爆發呈增長趨勢。這些致病菌通過食物鏈進入人體胃腸道，粘附腸粘膜后擴增繁殖，入侵腸上皮細胞，被單核巨噬細胞吞噬，并隨之擴散到局部淋巴結，最后到達內臟器官，從而引起疾病的發生，如單核增生李斯特菌是自然界存在的一種強致病菌，100個CFU就能導致死亡。

粘附是腸道致病菌引發腹瀉的前提，抑制致病菌的粘附，使之成為過路菌被排出體外，讓其喪失在腸道繁殖的條件，從而達到防治腹瀉的目的。雙歧桿菌在體外與致病菌競爭黏附上皮細胞中處于一定的優勢。Moroni等發現在與雙歧桿菌競爭黏附過程中，弱入侵型、中等入侵型和強入侵型的單核增生李斯特菌的侵襲力下降了38-90％不等，并且雙歧桿菌與單層細胞的預孵育能顯著抑制單核增生李斯特菌對細胞的粘附。鐘世順等報道雙歧桿菌分泌型黏附素(10-30μg/ml)的30min預孵育能明顯抑制產毒大腸桿菌或腸出血大腸桿菌對Lovo細胞的黏附。

益生菌與致病菌競爭共同黏附位點，導致空間占位效應，是益生菌抑制致病菌黏附的重要方式。asialo-GM1是致病菌及非致病菌黏附人類及動物粘膜表面的重要糖類物質，約氏乳桿菌La1對腸致病性大腸桿菌、腸出血性大腸桿菌的抑制作用即源于其占據了致病菌的黏附位點。Mukai等發現路氏乳桿菌和幽門螺桿菌菌競爭相同的糖基位點，路氏乳桿菌的黏附占據腸上皮細胞的黏附位點后導致幽門螺桿菌失去黏附位點而被排出體外。因此，腸道細胞表面糖類物質作為益生菌和致病菌的共同定向結合位點在抑菌機理中起著重要的作用。另一方面，益生菌通過與致病菌競爭糖基的不同部位，起到空間排阻的效果，達到抑制致病菌的目的。大腸桿菌I型偏好黏附上皮細胞中的甘露糖α1-3甘露糖位點，此位點并不是某些約氏乳桿菌菌株的黏附位點，約氏乳桿菌對于大腸桿菌I型的抑制是可能是由于其占據上述位點的附近糖基位點，引起菌體的空間排阻效應，而影響致病菌的結合。

目前治療腹瀉普遍采用的是抗生素療法，抗生素有一定副作用，同時可能導致耐藥株的產生，從而進一步增加治療難度。近年來，人們在研究替代抗生素治療腹瀉方面做了大量的工作，尤其是通過益生菌來預防和治療致病菌引起的感染，更是目前研究的熱點。益生菌通過黏附、競爭、排斥、占位及產生抗菌物質等機制，抑制胃腸道內的致病菌，保持原籍菌群的優勢，從而促進人體和動物體的健康。本發明就是通過來源長雙歧桿菌的粘附抑制蛋白Aip競爭致病菌在腸道細胞的結合位點，阻抑致病菌粘附腸道，達到防治腹瀉的目的。

發明內容

本發明的目的在于提供一種長雙歧桿菌粘附抑制蛋白Aip在防治腹瀉中的應用，Aip具有較強的抑制致病菌粘附腸上皮細胞的能力，且不影響益生菌的粘附功能，使用安全、無殘留、不產生抗藥性。

本發明是這樣來實現的，其特征是：粘附抑制蛋白Aip阻抑致病菌粘附定植于腸道，而不影響益生菌的粘附，從而防治致病菌引發的腹瀉，維持腸道微生態平衡。

所述的粘附抑制蛋白Aip的制備方法為：

(1)將新鮮培養的長雙歧桿菌按1％接入300mL?MRS液體培養基，37℃、厭氧培養16-18h，8000rpm離心3min，收集發酵液上清；

(2)分別按照15％和75％飽和度用硫酸銨分級沉淀上清，最后沉淀用20mLPBS重懸，脫鹽，真空冷凍干燥；

(3)取1ml?0.5mg/ml的粗蛋白用預裝離子柱Hitrap?Q?FF進行離子交換層析，首先用起始緩沖液平衡層析柱，所述的起始緩沖液為0.025mol/L磷酸鉀緩沖液和0.001mol/L?EDTA的混合物并調節pH為8.0，用洗脫緩沖液進行線性濃度梯度洗脫，流速為1ml/min，分別收集各洗脫峰，電泳檢測，確定目的峰所在，所述的洗脫緩沖液為0.025mol/L磷酸鉀緩沖液、1mol/L氯化鉀和0.001mol/L?EDTA的混合物并調節pH為8.0；

(4)收集的目的峰再用分子篩柱HitrapSuperdex75進行分離，流動相為Millipore超純水，流速為0.5ml/min，收集各流出峰，電泳檢測，確定目的峰所在。