[發明專利]用手性柱分離鑒定及制備葫蘆素混合物中單體物質的HPLC方法

有效

• 申請號: 201010209418.5
• 申請日: 2010-06-25
• 公開（公告）號: CN102297905A
• 公開（公告）日: 2011-12-28
• 發明（設計）人: 鄧意輝;李曉峰;季秀峰
• 申請（專利權）人: 沈陽藥科大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/36;G01N30/08
• 代理公司: 沈陽杰克知識產權代理有限公司 21207
• 代理人: 李宇彤

技術領域

本發明屬于醫藥技術領域，具體涉及一種葫蘆素混合物的分離、制備及鑒定，更具體的是涉及采用手性柱進行葫蘆素混合物的分離、鑒定和制備。

背景技術

葫蘆素(Cucurbitacins)是一類高度氧化三萜類成分，在植物中的分布很廣，有二百余種之多。藥理實驗表明，葫蘆素具有抗腫瘤、抗化學致癌、保肝、提高免疫力等多種生物活性，我國從甜瓜蒂中提取的葫蘆素制劑已經用于臨床，其片劑收載于衛生部藥品標準《中藥成方制劑》第十九冊。臨床試驗證明其對原發性肝癌和肝炎的治療有顯著療效。葫蘆素片用于治療慢性肝炎(藥學通報1986，21(6)：357葫蘆素片)，經上海、北京、重慶等地十三家醫院臨床使用，其有效率為75.2％，顯效率為44.6％。臨床上觀察到葫蘆素片能較全面地改善慢性肝炎常見癥狀和主要體征，并有明顯的降酶、降濁和降膽紅質作用，停藥后不引起S-GPT反跳，對蛋白倒置和高球蛋白血癥也有明顯的糾正作用，還能提高慢性肝炎患者的非特異性細胞免疫能力，無明顯毒副作用。此外，葫蘆素片還能用于治療原發性肝癌，經上海、北京、廣西等地六家醫院臨床觀察，統計169例，有效率69％，顯效率39％。臨床觀察表明，該藥與5-氟脲嘧啶比較，其改善癥狀、消除肝痛、縮小瘤體、延長生存期、恢復體力等，均優于對照組，且無一般化療藥物的毒副作用(中草藥1987，18(10)：21治療肝炎、肝癌新藥葫蘆素片；新藥與臨床1984，3(2)：21葫蘆素治療原發性肝癌50例臨床觀察；中草藥1992，23(11)：605葫蘆素的藥理與臨床應用)。還有作者將葫蘆素片與化療藥聯合，治療中晚期肝癌，中位生存期由單一化療藥的6.1±7.12月，提高到12.5±7.54月(癌癥1989，8(6)：434葫蘆素片加化療藥治療中晚期原發性肝癌的臨床療效觀察)。葫蘆素類物質多為水中難溶性化合物，其制劑的體外溶出與體內吸收均存在較大問題，從而影響藥物療效的發揮。解決難溶性藥物水溶性的一個重要方法是采用納米技術，我們在完成國家973課題(國家重點基礎研究發展計劃2009CB903302)時發現，納米化過程中，藥物的表面積大大增加，光解、水解等穩定性問題更易產生，建立合理的分析方法極為重要。

目前用于臨床的葫蘆素提取物以葫蘆素B為主要成分，其中還包含葫蘆素E等多種成分，而其法定質量標準中僅對葫蘆素B進行了測定，規定葫蘆素原料中含葫蘆素B不低于60％，對于其他成分未進行控制，這對于藥品的安全性、有效性和質量可控性都是極為不利的。在歐美國家上市銷售的藥品中，包括原料藥和制劑均應有它的雜質列表，對生產制造和精制工藝中產生的，含量超過0.1％的雜質均需要進行結構確證，并進行相關的毒理學研究，目前國內對藥品中雜質控制的要求已經達到甚至超過了國際標準，因此分離葫蘆素原料中的雜質并對其進行結構確證是非常有必要的。文獻報道葫蘆素類化合物的分離多采用硅膠柱色譜法，但由于各種葫蘆素的結構極為相似，此法分離效果較差，存在操作繁瑣、重復性不好、并且使用到氯仿、苯等有毒試劑的缺點，導致各種葫蘆素單體的制備較為困難。

葫蘆素含量測定的方法大多采用反相高效液相色譜法，部頒標準《中藥成方制劑》第十九冊中，對葫蘆素原料及片劑中的葫蘆素B進行了測定，亦有文獻報道用高效液相色譜法測定葫蘆素片的含量及均勻度(藥物分析雜質1991，11(4)：245高效液相色譜法用于葫蘆素片的含量及片劑均勻度測定)，還有人研究了用HPLC法測定滴丸劑中葫蘆素B的含量(中草藥2003，34(5)：421RP-HPLC法測定葫蘆素滴丸中葫蘆素B的含量)。最近，李曉峰等采用HPLC同時測定葫蘆素原料中葫蘆素B和葫蘆素E的含量(李曉峰劉克非鄧意輝HPLC法同時測定葫蘆素原料中葫蘆素B和葫蘆素E的含量沈陽藥科大學學報2010?27(02)：123-125)。我們在實驗中發現，葫蘆素(包括瓜蒂素)中除了葫蘆素B、E外，尚有幾種其他成分，而同時測定葫蘆素原料藥與制劑中葫蘆素B及其共存物質含量的方法尚未見報道。在本發明的相關實驗中，曾使用C18柱、C8柱、氨基柱、純硅膠柱等常用色譜柱，均不能有效的分離以上化合物。

發明內容

為解決現有技術存在的上述問題，發明人旨在提供一種分離效果好、操作簡單、準確度高和專屬性強的高效液相色譜法(HPLC方法)，用于分離鑒定葫蘆素混合物，測定出葫蘆素混合物中各種葫蘆素單體的含量，并可制備出各種葫蘆素單體。

為實現本發明的目的，發明人提供如下技術方案：

一種用手性柱分離鑒定葫蘆素混合物的HPLC方法，其色譜工藝條件為：