[發明專利]一種固定化酶整體毛細管色譜柱及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201010209294.0
• 申請日: 2010-06-25
• 公開（公告）號: CN101876653A
• 公開（公告）日: 2010-11-03
• 發明（設計）人: 錢俊青;盧時勇;張錚
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: G01N30/60
• 分類號: G01N30/60;G01N30/56;B01D15/22
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;王兵

(一)技術領域

本發明屬色譜柱制備技術，特別涉及一種固定化酶整體毛細管色譜柱及其制備和應用。

(二)背景技術：

固定化酶色譜柱的制備，目前國內外已有開展?，F有技術的制備方法是以顆粒載體固定酶，裝柱而成。顆粒載體種類較多，可以是大孔吸附樹脂，離子交換樹脂，也可以是葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠等。固定酶的方式有吸附法，如大孔樹脂固定酶，也有共價交聯法，如葡聚糖固定酶。由于顆粒載體固定酶再裝柱，因而，無法制成柱徑在1毫米以下的毛細管固定化柱。顆粒載體固定酶色譜柱主要應用于親和層析分離，分離純化與柱中固定的酶具有親和力的成分。固定化酶整體毛細管色譜柱目前國內外均處于研究階段，固定化材料與毛細管的選用有較多種類，應用領域也處于探索之中。

(三)發明內容

本發明的目的是制備一種可應用于篩選與酶具有親和作用的化合物的固定化酶整體毛細管色譜柱。為提高篩選靈敏度，采用溶膠凝膠法固定酶，制成整體毛細管柱。

本發明采用的技術方案是：

一種固定化酶整體毛細管色譜柱，所述的固定化酶整體毛細管色譜柱按照以下方法制備得到：

(1)將四乙氧基硅烷與甘油以質量比1∶0.2～0.6混合后，再加入四乙氧基硅烷質量2～3％的強酸性離子交換樹脂，在35～45℃下，攪拌混合72～120小時，然后過濾除去強酸性離子交換樹脂，取濾液減壓蒸餾除去甘油與反應生成的乙醇(通常在真空度300Pa、25℃溫度下進行減壓蒸餾)，得到改性硅烷，改性硅烷中加入改性硅烷質量1.2～1.6倍的水和改性硅烷質量1.5～2.5％的1mol/L的磷酸溶液，混勻得到改性硅烷溶液；

(2)在濃度40mmol/L、pH值為7.0～7.5的磷酸緩沖液中加入平均分子量為400～1500的聚乙二醇和酶，配成含有酶和聚乙二醇的磷酸緩沖液，所述含有酶和聚乙二醇的磷酸緩沖液中聚乙二醇的濃度為70～90mg/mL，酶的濃度為90～100mg/mL，將含有酶和聚乙二醇的磷酸緩沖液與步驟(1)得到的改性硅烷溶液以質量比1∶1混合，攪拌均勻后得混合液，用注射器注入所述的混合液預處理過的玻璃毛細管中，注滿后靜置5～10分鐘，然后將玻璃毛細管浸入40mmol/L、pH值7.0的磷酸緩沖液中，于3～7(優選～5℃)下靜置7～9天，制得所述固定化酶整體毛細管色譜柱，所述酶為胰蛋白酶、α葡萄糖苷酶或血管緊張素轉化酶。

所述預處理過的玻璃毛細管按照以下方法制備得到：玻璃毛細管用無水乙醇浸泡1～3小時后，用注射器將體積百分比濃度為10％的氨丙基三乙氧硅烷的無水乙醇溶液注入毛細管中，注滿后靜置30～40分鐘，再用無水乙醇沖洗干凈，于90℃烘箱烘干30～40分鐘，制得所述預處理過的玻璃毛細管，所述玻璃毛細管的內徑為0.2～1.0毫米，管長通常為5～20厘米。

所述步驟(1)中，所述強酸性離子交換樹脂優選732型強酸性離子交換樹脂、717型強酸性離子交換樹脂、D001型強酸性離子交換樹脂或D201型強酸性離子交換樹脂。

本發明還提供一種固定化酶整體毛細管色譜柱的制備方法，所述的方法包括以下步驟：

a、玻璃毛細管用無水乙醇浸泡1～3小時后，用注射器將體積百分比濃度為10％的氨丙基三乙氧硅烷的無水乙醇溶液注入毛細管中，注滿后靜置30～40分鐘，再用無水乙醇沖洗干凈，于90℃烘箱烘干30～40分鐘，制得預處理過的玻璃毛細管，所述玻璃毛細管的內徑為0.2～1.0毫米，管長為5～20厘米；

b、將四乙氧基硅烷與甘油以質量比1∶0.2～0.6混合后，再加入四乙氧基硅烷質量2～3％的強酸性離子交換樹脂，在35～45℃下，攪拌混合72～120小時，然后過濾除去強酸性離子交換樹脂，取濾液減壓蒸餾除去甘油與乙醇(通常在真空度300Pa、25℃溫度下進行減壓蒸餾)，得到改性硅烷，改性硅烷中加入改性硅烷質量1.2～1.6倍的水和改性硅烷質量1.5～2.5％的1mol/L的磷酸溶液，混勻得到改性硅烷溶液；