[發明專利]一種固定化酶整體毛細管色譜柱及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201010209294.0
• 申請日: 2010-06-25
• 公開（公告）號: CN101876653A
• 公開（公告）日: 2010-11-03
• 發明（設計）人: 錢俊青;盧時勇;張錚
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: G01N30/60
• 分類號: G01N30/60;G01N30/56;B01D15/22
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;王兵

1.一種固定化酶整體毛細管色譜柱，其特征在于所述的固定化酶整體毛細管色譜柱按照以下方法制備得到：

(1)將四乙氧基硅烷與甘油以質量比1∶0.2～0.6混合后，再加入四乙氧基硅烷質量2～3％的強酸性離子交換樹脂，在35～45℃下，攪拌混合72～120小時，然后過濾除去強酸性離子交換樹脂，取濾液減壓蒸餾除去甘油與生成的乙醇，得到改性硅烷，所述改性硅烷中加入改性硅烷質量1.2～1.6倍的水和改性硅烷質量1.5～2.5％的1mol/L的磷酸溶液，混勻得到改性硅烷溶液；

(2)在濃度40mmol/L、pH值為7.0～7.5的磷酸緩沖液中加入平均分子量為400～1500的聚乙二醇和酶，配成含有酶和聚乙二醇的磷酸緩沖液，所述含有酶和聚乙二醇的磷酸緩沖液中聚乙二醇的濃度為70～90mg/mL，酶的濃度為90～100mg/mL，將含有酶和聚乙二醇的磷酸緩沖液與步驟(1)得到的改性硅烷溶液以質量比1∶1混合，攪拌均勻后得混合液，用注射器將所述的混合液注入預處理過的玻璃毛細管中，注滿后靜置5～10分鐘，然后將玻璃毛細管浸入40mmol/L、pH值7.0的磷酸緩沖液中，于3～7℃下靜置7～9天，制得所述固定化酶整體毛細管色譜柱，所述酶為胰蛋白酶、α葡萄糖苷酶或血管緊張素轉化酶。

2.如權利要求1所述的固定化酶整體毛細管色譜柱，其特征在于所述預處理過的玻璃毛細管按照以下方法制備得到：玻璃毛細管用無水乙醇浸泡1～3小時后，用注射器將體積百分比濃度為10％的氨丙基三乙氧硅烷的無水乙醇溶液注入毛細管中，注滿后靜置30～40分鐘，再用無水乙醇沖洗干凈，于90℃烘箱烘干30～40分鐘，制得所述預處理過的玻璃毛細管，所述玻璃毛細管的內徑為0.2～1.0毫米。

3.如權利要求2所述的固定化酶整體毛細管色譜柱，其特征在于所述玻璃毛細管的管長為5～20厘米。

4.如權利要求1所述的固定化酶整體毛細管色譜柱，其特征在于所述強酸性離子交換樹脂為732型強酸性離子交換樹脂、717型強酸性離子交換樹脂、D001型強酸性離子交換樹脂或D201型強酸性離子交換樹脂。

5.如權利要求1所述的固定化酶整體毛細管色譜柱，其特征在于所述步驟(1)中，所述取濾液減壓蒸餾是在真空度300Pa、25℃溫度下進行減壓蒸餾。

6.如權利要求1所述的固定化酶整體毛細管色譜柱的制備方法，其特征在于所述的方法包括以下步驟：

a、玻璃毛細管用無水乙醇浸泡1～3小時后，用注射器將體積百分比濃度為10％的氨丙基三乙氧硅烷的無水乙醇溶液注入毛細管中，注滿后靜置30～40分鐘，再用無水乙醇沖洗干凈，于90℃烘箱烘干30～40分鐘，制得預處理過的玻璃毛細管，所述玻璃毛細管的內徑為0.2～1.0毫米，管長為5～20厘米；

b、將四乙氧基硅烷與甘油以質量比1∶0.2～0.6混合后，再加入四乙氧基硅烷質量2～3％的強酸性離子交換樹脂，在35～45℃下，攪拌混合72～120小時，然后過濾除去強酸性離子交換樹脂，取濾液在真空度減壓蒸餾除去甘油與乙醇，得到改性硅烷，改性硅烷中加入改性硅烷質量1.2～1.6倍的水和改性硅烷質量1.5～2.5％的1mol/L的磷酸溶液，混勻得到改性硅烷溶液；

c、在濃度40mmol/L、pH值為7.0～7.5的磷酸緩沖液中加入平均分子量為400～1500的聚乙二醇和酶，配成含有酶和聚乙二醇的磷酸緩沖液，所述含有酶和聚乙二醇的磷酸緩沖液中聚乙二醇的濃度為70～90mg/mL，酶的濃度為90～100mg/mL，將含有酶和聚乙二醇的磷酸緩沖液與步驟b得到的改性硅烷溶液以質量比1∶1混合，攪拌均勻后得混合液，用注射器將所述的混合液注入步驟a制得的預處理過的玻璃毛細管中，注滿后靜置5～10分鐘，然后將玻璃毛細管浸入40mmol/L、pH值7.0的磷酸緩沖液中，于3～7℃下靜置7～9天，制得所述固定化酶整體毛細管色譜柱，所述酶為胰蛋白酶、α葡萄糖苷酶或血管緊張素轉化酶。

7.如權利要求1所述的固定化酶整體毛細管色譜柱應用于篩選與所述固定化酶整體毛細管色譜柱中固定的酶有親和作用的化合物。

8.如權利要求7所述的應用，其特征在于所述應用的方法為：待篩選化合物用水配成濃度小于1μg/mL的三種不同濃度的樣品溶液，分別用注射泵注入含有待驗親和作用的酶的固定化酶整體毛細管色譜柱中，控制流速4μL/min，跟蹤檢測流出液中待篩選化合物的濃度，當流出液中待篩選化合物的濃度與樣品溶液的初始濃度相同時，記錄為濃度平衡時間，若三種不同濃度的樣品溶液的濃度平衡時間相同，表示待篩選化合物與固定化酶整體毛細管色譜柱中固定的酶無親和作用，若三種不同濃度的樣品溶液的濃度平衡時間有差別，表示待篩選化合物與固定化酶整體毛細管色譜柱中固定的酶有親和作用。