[發明專利]鴨病毒性腸炎病毒感染性重組克隆系統及構建方法和應用

有效

• 申請號: 201010208250.6
• 申請日: 2010-06-13
• 公開（公告）號: CN102277368A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發明（設計）人: 陳化蘭;柳金雄;步志高;姜永萍
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/38;C12N7/01;A61K39/245;A61P31/20;C12R1/93
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 王旭

技術領域

本發明涉及病毒疫苗株感染性克隆領域，具體地，涉及鴨病毒性腸炎病毒疫苗株感染性克隆領域，更具體地涉及鴨病毒性腸炎病毒疫苗株感染性重組克隆系統，及其構建方法和應用。

背景技術

鴨病毒性腸炎病毒(duck?enteritis?virus，DEV)，又稱鴨瘟病毒。能引起鴨、鵝和其它雁形目禽類發生急性、熱性、敗血性為特征的烈性傳染病。但對DEV的研究相對于其它皰疹病毒而言相對比較少。故第八次國際病毒學分類委員會報告將其分類為皰疹病毒^[1]，而未能進一步將其進行分類。直到最近，其全序列才被全部測通^[2](GeneBank?EU082088)。

自上世紀80年代開始用痘病毒作為活疫苗載體研究以來，用痘病毒、腺病毒和皰疹病毒等作為活疫苗載體的研究已有大量報道。皰疹病毒基因組巨大，非必須基因多，可容納較大片段的外源基因的插入。但鴨病毒性腸炎病毒復制非必須區的研究到目前仍是空白。

發明內容

將皰疹病毒的基因組分段克隆到粘粒或質粒中，并用這些含有相互重疊區的基因組DNA片段轉染相應細胞拯救出病毒是研究皰疹病毒的幾種途徑之一，且已有大量報道。本研究成功在DEV疫苗株基因組中篩選出3個復制非必須區。

具體內容如下：

1.構建鴨病毒性腸炎病毒感染性重組克隆系統或試劑盒的方法，所述方法包括：

1)切斷所述鴨病毒性腸炎病毒的DNA，

2)將切斷后的鴨病毒性腸炎病毒DNA片段連接到粘粒上，

3)選擇多個粘粒組成所述鴨病毒性腸炎病毒感染性克隆系統，其中每個粘粒中克隆有鴨病毒性腸炎病毒疫苗株基因片段，所述鴨病毒性腸炎病毒疫苗株基因片段含有相互重疊的區域，并拼接覆蓋鴨病毒性腸炎病毒疫苗株全基因組，和

4)將外源基因插入至少一個所述粘粒中的復制非必須區。

2.以上1所述的構建鴨病毒性腸炎病毒感染性重組克隆系統或試劑盒的方法，其特征在于所述粘粒是Fosmid，優選為pCC1?Fos。

3.以上1或2所述的構建鴨病毒性腸炎病毒感染性重組克隆系統的方法，其特征在于在所述鴨病毒性腸炎病毒是鴨病毒性腸炎病毒CVCCAV1222(GeneBank?EU082088)。

4.以上1-3中任一項所述的構建鴨病毒性腸炎病毒感染性重組克隆系統或試劑盒的方法，其特征在于所述多個粘粒是5個粘粒，優選地，所述5個粘粒分別為pFOS1、pFOS2、pFOS3、pFOS4和pFOS5，其中克隆的鴨病毒性腸炎病毒疫苗株基因片段的序列分別為鴨病毒性腸炎病毒CVCCAV1222(GeneBank?EU082088)的1-44551位、36852-75346位、69314-109887位、98197-129146位和119308-158091位。

5.以上1-4中任一項所述的構建鴨病毒性腸炎病毒感染性重組克隆系統或試劑盒的方法，其特征在于所述復制非必須區位于pFOS1中的UL45和UL46基因之間，pFOS1中的UL41基因內，或pFOS5中的US7和US8基因之間。

6.根據以上1-5中任一項所述方法構建的鴨病毒性腸炎病毒感染性重組克隆系統或試劑盒。

7.一種鴨病毒性腸炎病毒感染性重組克隆系統或試劑盒，其特征在于所述系統或試劑盒包括多個粘粒，每個粘粒中克隆有鴨病毒性腸炎病毒疫苗株基因片段，所述鴨病毒性腸炎病毒疫苗株基因片段含有相互重疊的區域，并拼接覆蓋鴨病毒性腸炎病毒疫苗株全基因組，其中至少一個所述粘粒的復制非必須區中插入有外源基因。

8.以上6或7的鴨病毒性腸炎病毒感染性重組克隆系統或試劑盒用于構建重組鴨病毒性腸炎病毒的應用。

9.利用以上1-5中任一項的方法或利用以上6或7的系統或試劑盒獲得的重組鴨病毒性腸炎病毒株，例如rDEVul4546，其保藏號為CCTCCV201012；rDEVus78，其保藏號為CCTCC?V201010；和rDEVul41，其保藏號為CCTCC?V201011。

10.以上9的重組鴨病毒性腸炎病毒株在制備用于預防所述鴨病毒性腸炎病毒感染所引起的疾病的藥物中的應用。

在以上1中所述的方法中，步驟2)中的切斷后的鴨病毒性腸炎病毒DNA片段可以通過在兩端連接所述鴨病毒性腸炎病毒中所不含或只含有少數幾個酶切位點的內切酶序列，諸如Fse?I-Sbf?I-Pme?I接頭而連接到粘粒上。