[發明專利]一種核酸檢測方法及其專用試劑盒

無效

• 申請號: 201010206550.0
• 申請日: 2010-06-12
• 公開（公告）號: CN101845511A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發明（設計）人: 王景林;陳唯軍;高興;李春娟;吳偉力;蘇利波;康琳;高珊
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及核酸雜交和檢測技術。

背景技術

核酸雜交技術是基因芯片及其他核酸檢測領域的重要技術，普通的核酸雜交方法是將探針與樣本基因進行一次雜交，可較特異和快速地獲得樣本基因的信息，但由于設計的探針不夠特異和樣本基因中含有與靶基因序列相似的基因等原因，會發生非特異雜交，使檢測結果出現假陽性。

發明內容

本發明的目的在于提供一種核酸檢測的試劑盒，利用該試劑盒可以減少核酸檢測結果的假陽性。

本發明提供的試劑盒包括：

捕獲探針，所述捕獲探針包括由20-50個核苷酸組成的單鏈核酸片段A，所述單鏈核酸片段A與待測核酸片段的區域片段A’完全反向互補或完全相同，所述單鏈核酸片段A的3’末端是所述捕獲探針的3’末端；

和雜交探針，所述雜交探針包括由20-30個核苷酸組成的單鏈核酸片段B，所述單鏈核酸片段B與待測核酸片段的區域片段B’完全反向互補或完全相同，所述單鏈核酸片段B的5’末端是所述雜交探針的5’末端；

所述單鏈核酸片段A的3’末端有羥基，所述單鏈核酸片段B的5’末端有磷酸基團；所述待測核酸片段包括自上游至下游依次連接的區域片段A’和區域片段B’，即區域片段A’和區域片段B’之間沒有核苷酸相間隔。

為減少雜交時的空間位阻，優選地，上述捕獲探針還包括連接在單鏈核酸片段A的5’末端的0-30個T；優選是10個T。

為了將捕獲探針牢固地固定到基片上，上述捕獲探針的5’末端經氨基修飾；采用其他載體的反應模式時，上述捕獲探針的5’末端進行對應的修飾。

在一種實施方式中，上述雜交探針的3’末端連有探針標記物，所述探針標記物優選是熒光素。

在另一種實施方式中，上述試劑盒還包括標記探針，所述標記探針包括帶有探針標記物的通用片段C，所述通用片段C的3’末端是所述標記探針的3’末端，所述探針標記物優選是熒光素；

所述雜交探針還包括連接在所述單鏈核酸片段B的3’末端的通用片段B；

所述通用片段C與所述通用片段B完全反向互補。

上述通用片段B是相對非常保守的序列，與公布的細菌等多數微生物基因組序列雜交幾率較小；進一步，通用片段B具體應該是與所述捕獲探針以及所述待測核酸片段均不雜交的片段；通用片段B優選是序列表中序列2所示的20個核苷酸組成的片段。

本發明的另一目的在于提供一種核酸檢測的方法。

本發明提供的核酸檢測的方法，包括如下步驟：

1)將任一上述的試劑盒中的捕獲探針制成基因芯片，然后將待測核酸片段與所述基因芯片進行第一次雜交；

2)在步驟1)的基礎上，將所述試劑盒中的雜交探針加到所述基因芯片上進行第二次雜交；

3)在步驟2)的基礎上，將所述捕獲探針的單鏈核酸片段A的3’末端的羥基與所述雜交探針的單鏈核酸片段B的5’末端的磷酸基團在連接酶的作用下形成穩定化學鍵，從而所述捕獲探針與所述雜交探針連接，得到探針連接物；

4)在步驟3)的基礎上，針對探針連接物上進行檢測。

在步驟2)中，所述雜交探針是上述一種實施方式中所述的雜交探針；步驟4)中，所述針對探針連接物進行檢測為利用芯片掃描儀針對上述一種實施方式中所述的熒光素進行掃描，得到熒光信號。

在步驟2)中，所述雜交探針是上述另一種實施方式中的雜交探針；步驟4)中，所述針對探針連接物進行檢測包括如下步驟：在步驟3)的基礎上，往所述基因芯片中加入上述另一種實施方式中所述的標記探針進行顯色雜交，然后利用芯片掃描儀針對上述另一種實施方式中所述的熒光素進行掃描，得到熒光信號。

本發明通過設計兩條序列位置相鄰的捕獲探針、雜交探針分別與靶基因進行的兩次雜交，在雜交后進行位點特異連接反應，結合強烈洗脫的方法，增強核酸檢測的特異性，減少了假陽性結果。本發明能特異檢測細菌、病毒、寄生蟲等多種物種的核酸(DNA或RNA)，并可用于96孔板、磁珠等進行固相、液相雜交的其他反應模式。

附圖說明

圖1為直接標記法檢測芯片掃描結果。

圖2為復雜的標記探針信號放大法檢測芯片掃描結果。

圖3為簡單直接標記法流程示意圖。

圖4為復雜標記探針信號放大法流程示意圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明并不限于以下實施例。

下述實施例中，如無特殊說明，均為常規方法。

實施例1、直接標記法檢測

操作過程的流程示意圖如圖3所示。

一、制作探針