[發(fā)明專利]一種測定腸道病毒71型滅活疫苗抗原滴度的檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010206469.2
• 申請日: 2010-06-22
• 公開（公告）號: CN101881774A
• 公開（公告）日: 2010-11-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 高孟;周康鳳;姜云水;羅永能;唐彩華;高麗美;朱蓮;王平;毛子安;毛江森
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江普康生物技術(shù)股份有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/569;G01N33/543;G01N21/31;G01N33/531
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 韓介梅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是用于腸道病毒71型(Enterovirus?71，EV71)的一種靈敏特異的測定腸道病毒71型滅活疫苗抗原滴度的酶聯(lián)免疫檢測方法

背景技術(shù)

近年來，手足口疾病肆虐我國大部分地區(qū)，給人們帶來了巨大的危害。大量的流行病學(xué)研究表明，腸道病毒71型是引發(fā)手足口病的主要病原體之一。EV71屬于小RNA病毒科，腸道病毒屬成員。該病毒的感染疾病，多發(fā)生于5歲以下的嬰幼兒，可引起手、足、口腔等部位的皰疹，個別患者可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等并發(fā)癥，具有較高的致殘和致死率。因此研制安全、有效的EV71疫苗來防控手足口疾病的傳播，具有非常重要的意義。目前，在市場上還未見有相關(guān)的疫苗，而在研發(fā)的疫苗主要包括甲醛滅活疫苗、類病毒顆粒(VLP)疫苗和DNA疫苗等，其中又以甲醛滅活疫苗的進(jìn)展最快。

在EV71滅活疫苗的研制過程中，均需要進(jìn)行EV71病毒抗原(EV71Ag)的檢測，盡管EV71病毒能產(chǎn)生細(xì)胞病變(CPE)，能夠通過病毒感染組織培養(yǎng)細(xì)胞檢測來進(jìn)行EV71抗原含量的測定。但是該方法周期較長，往往需要數(shù)天時間才能得到結(jié)果，并且由于CPE只能檢測有感染活性的病毒使得其無法正確檢測出滅活疫苗中的抗原含量，如空泡病毒，失活病毒等，因此無法在疫苗的生產(chǎn)過程中進(jìn)行有效、即時、正確的監(jiān)控，從而給EV71滅活疫苗的生產(chǎn)工藝研發(fā)帶來了一些不便和瓶頸。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是要克服CPE只能檢測有感染活性的病毒使得其無法正確檢測出滅活疫苗中的抗原含量狀況(情況)，利用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法(ELISA)，提供一種特異性好、靈敏度高、使用方便、檢測快速的腸道病毒71型滅活疫苗抗原的檢測方法，可以應(yīng)用于腸道病毒71型滅活疫苗生產(chǎn)及質(zhì)量檢定。

本發(fā)明通過下列技術(shù)方案完成：一種腸道病毒71型滅活疫苗抗原的檢測方法，其特征在于經(jīng)過下列步驟：

A.酶標(biāo)板的預(yù)制

A.1酶標(biāo)板的包被：用碳酸鹽緩沖液(pH9.0)將兔抗EV71血清抗體稀釋至5～20微克/毫升，按50～100微升/孔的量，加入酶標(biāo)板的空中，放于4℃孵育過夜，用PBS洗液洗板3～5次；

A.2酶標(biāo)板的封閉：用封閉液按200微升/孔的量加入封閉液，37℃孵育1～2小時，PBS洗液洗板3～5次，晾干，冰箱4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

B.按50～100微升/孔的量，在步驟1的預(yù)制酶標(biāo)板的孔中，加入不同稀釋度的待檢抗原，并設(shè)陰性對照和空白調(diào)零孔，放入濕盒中，放入37℃搖床，180轉(zhuǎn)/分鐘震蕩培養(yǎng)1～2小時后，PBS洗液洗板3～5次；

C.按50～100微升/孔的量，在步驟2.1的酶標(biāo)板的各孔中，加入稀釋度為1∶800～1∶1500的鼠抗EV71病毒單克隆抗體，放入濕盒中，放入37℃搖床，180轉(zhuǎn)/分鐘震蕩培養(yǎng)1～2小時，PBS洗液洗板3～5次；

D.按50～100微升/孔的量，在步驟2.2的酶標(biāo)板的各孔中，加入稀釋度為1∶1000～1∶2000的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)抗體，放入37℃搖床，180轉(zhuǎn)/分鐘震蕩培養(yǎng)0.5～1小時，PBS洗液洗板3～5次；

E.按50～100微升/孔的量，在步驟2.3的酶標(biāo)板的各孔中，加入OPD顯色液，放入濕盒中，于37℃保溫10～20分鐘；

F.按50～100微升/孔的量，在步驟2.4的酶標(biāo)板的各孔中，加入終止液，而后置于酶標(biāo)儀上，在492nm波長下，用空白孔調(diào)零后檢測吸光度A值，即得到檢測結(jié)果。

根據(jù)檢測的結(jié)果按下列條件進(jìn)行判定：

域值(Cut?off)＝2.1×N(N為陰性對照平均A值，陰性對照的平均值大于0.05，按實際值計算；若陰性對照的平均值小于0.05則按0.05計算)，標(biāo)本A值小于Cut?off值為陰性，大于等于Cut?off值為陽性。

所述A.1步驟中的兔抗EV71血清抗體按下面的方法制備：

a、將病毒的濃度稀釋成LogTCID50/ml(感染滴度)為7.0～8.0(即將病毒作10^7.0～10^8.0稀釋，每孔接種1毫升，可使半數(shù)的組織細(xì)胞發(fā)生病變)，吸取1～2毫升的病毒接種于大耳白兔子，分3～4個部位皮下注射；

b、12～15天后，以同樣的劑量進(jìn)行加強(qiáng)免疫；

c、在初次注射免疫后的第4～6周采血，處理血清；

d、用市售的親和純化柱純化血清中的抗體。

所述B步驟中的鼠抗EV71病毒單克隆抗體為市購。