[發(fā)明專利]一種測定腸道病毒71型滅活疫苗抗原滴度的檢測方法無效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201010206469.2 | 申請日： | 2010-06-22 |
| 公開（公告）號： | CN101881774A | 公開（公告）日： | 2010-11-10 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 高孟;周康鳳;姜云水;羅永能;唐彩華;高麗美;朱蓮;王平;毛子安;毛江森 | 申請（專利權(quán)）人： | 浙江普康生物技術(shù)股份有限公司 |
| 主分類號： | G01N33/577 | 分類號： | G01N33/577;G01N33/569;G01N33/543;G01N21/31;G01N33/531 |
| 代理公司： | 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200 | 代理人： | 韓介梅 |
| 地址： | 310013 浙江*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 測定 腸道病毒 71 型滅活 疫苗 抗原 檢測 方法 | ||
1.一種測定腸道病毒71型滅活疫苗抗原滴度的檢測方法，其特征在于具有如下步驟：
A.酶標板的預制
A.1酶標板的包被：用碳酸鹽緩沖液將兔抗EV71血清抗體稀釋至5～20微克/毫升，按50～100微升/孔的量，加入酶標板的空中，放于4℃孵育過夜，用磷酸鹽緩沖液洗液洗板3～5次；
A.2酶標板的封閉：用封閉液按200微升/孔的量加入封閉液，37℃孵育1～2小時，磷酸鹽緩沖液洗液洗板3～5次，晾干，冰箱4℃保存?zhèn)溆茫?/p>
B.按50～100微升/孔的量，在步驟1的預制酶標板的孔中，加入不同稀釋度的待檢抗原，并設(shè)陰性對照和空白調(diào)零孔，放入濕盒中，放入37℃搖床，180轉(zhuǎn)/分鐘震蕩培養(yǎng)1～2小時后，磷酸鹽緩沖液洗液洗板3～5次；
C.按50～100微升/孔的量，在步驟2.1的酶標板的各孔中，加入稀釋度為1∶800～1∶1500的鼠抗EV71病毒單克隆抗體，放入濕盒中，放入37℃搖床，180轉(zhuǎn)/分鐘震蕩培養(yǎng)1～2小時，磷酸鹽緩沖液洗液洗板3～5次；
D.按50～100微升/孔的量，在步驟2.2的酶標板的各孔中，加入稀釋度為1∶1000～1∶2000的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠免疫球蛋白G抗體，放入37℃搖床，180轉(zhuǎn)/分鐘震蕩培養(yǎng)0.5～1小時，磷酸鹽緩沖液洗液洗板3～5次；
E.按50～100微升/孔的量，在步驟2.3的酶標板的各孔中，加入OPD顯色液，放入濕盒中，于37℃保溫10～20分鐘；
F.按50～100微升/孔的量，在步驟2.4的酶標板的各孔中，加入終止液，而后置于酶標儀上，在492納米波長下，用空白孔調(diào)零后檢測吸光度A值，即得到檢測結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腸道病毒71型滅活疫苗抗原滴度檢測方法，其特征在于A步驟所述的兔抗EV71血清抗體經(jīng)過下列方法制備：
a、將病毒的濃度稀釋成感染滴度LogTCID50/ml為7.0～8.0，吸取1～2毫升的病毒接種于大耳白兔子，分3～4個部位皮下注射；
b、12～15天后，以同樣的劑量進行加強免疫；
c、在初次注射免疫后的第4～6周采血，處理血清；
d、用市售的親和純化柱純化血清中的抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腸道病毒71型滅活疫苗抗原滴度檢測方法，其特征在于洗板用磷酸鹽緩沖液洗液在洗板機上洗板或手工洗板。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腸道病毒71型滅活疫苗抗原滴度檢測方法，其特征在于磷酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液洗液、碳酸鹽緩沖液、終止液、OPD顯色液、封閉液為常規(guī)用液。
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