[發(fā)明專利]預(yù)防不同血清群?jiǎn)柼?hào)鉤端螺旋體感染的通用型三價(jià)基因重組疫苗及其制備方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010206462.0
• 申請(qǐng)日: 2010-06-21
• 公開（公告）號(hào): CN101874898A
• 公開（公告）日: 2010-11-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 嚴(yán)杰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 嚴(yán)杰
• 主分類號(hào): A61K48/00
• 分類號(hào): A61K48/00;A61K39/02;A61K39/116;C12N15/62;C12N15/70;C07K19/00;A61P31/04
• 代理公司: 杭州九洲專利事務(wù)所有限公司 33101
• 代理人: 王洪新

1.預(yù)防不同血清群?jiǎn)柼?hào)鉤端螺旋體感染的通用型三價(jià)基因重組疫苗，其特征在于所述融合基因lipL32/1-lipL21-ompL1/2的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ?ID?NO：5所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防不同血清群?jiǎn)柼?hào)鉤端螺旋體感染的通用型三價(jià)基因重組疫苗，其特征在于所述融合基因lipL32/1-lipL21-ompL1/2的柔性肽序列如SEQ?ID?NO：4所示。

3.預(yù)防不同血清群?jiǎn)柼?hào)鉤端螺旋體感染的通用型三價(jià)基因重組疫苗的制備方法，以問號(hào)鉤端螺旋體外膜脂蛋白LipL32/1、LipL21和穿膜蛋白OmpL1/2為抗原，采用基因工程技術(shù)構(gòu)建lipL32/1、lipL21和ompL1/2的人工融合基因lipL32/1-lipL21-ompL1/2及其原核表達(dá)系統(tǒng)，采用提純的同時(shí)含三種不同蛋白分子重組表達(dá)產(chǎn)物rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2為抗原的問號(hào)鉤端螺旋體基因工程疫苗。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的預(yù)防不同血清群?jiǎn)柼?hào)鉤端螺旋體感染的通用型三價(jià)基因重組疫苗的制備方法，包含以下的步驟：1)問號(hào)鉤端螺旋體lipL32/1、lipL21和ompL1/2基因的克隆和測(cè)序；2)lipL32/1-lipL21-ompL1/2人工融合基因及其原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建和測(cè)序；3)含IPTG的LB培養(yǎng)基中誘導(dǎo)三價(jià)重組蛋白抗原分子rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2表達(dá)，SDS-PAGE和BioRad凝膠圖象分析系統(tǒng)確定表達(dá)情況和產(chǎn)量；4)Ni-NTA親和層析法提純r(jià)LipL32/1-LipL21-OmpL1/2；5)rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2與氫氧化鋁(alum)混合后組成可注射疫苗劑型。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的預(yù)防不同血清群?jiǎn)柼?hào)鉤端螺旋體感染的通用型三價(jià)基因重組疫苗的方法，其特征在于：所說的融合基因rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2與氫氧化鋁混合液直接制備成注射液。

6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的預(yù)防不同血清群?jiǎn)柼?hào)鉤端螺旋體感染的通用型三價(jià)基因重組疫苗的方法，其特征在于問號(hào)鉤端螺旋體lipL32/1、lipL21和ompL1/2基因的克隆方法是：1)取用問號(hào)鉤端螺旋體黃疸出血群賴型賴株，將其接種、培養(yǎng)后離心收集問號(hào)鉤端螺旋體沉淀；2)分別取離心沉淀的問號(hào)鉤端螺旋體，用苯酚、-氯仿、提取、乙酸鈉和無水乙醇沉淀獲得基因組DNA；3)以問號(hào)鉤端螺旋體基因組DNA為模板，采用PCR分別擴(kuò)增lipL32/1、lipL21和ompL1/2基因，各上下游引物序列中均分別設(shè)置限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)Nde?I和XhoI；4)PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后，在紫外線下觀察目的DNA擴(kuò)增條帶；5)采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒，先提取目的DNA擴(kuò)增條帶；然后采用T-A克隆試劑盒，用T4?DNA連接酶將提純的DNA條帶與克隆質(zhì)粒如pUC-M-T連接；6)取用大腸桿菌DH5α株，將其接種、培養(yǎng)，然后收集細(xì)菌沉淀，制備成感受態(tài)E.coli?DH5α懸液；7)在上述感受態(tài)E.coli?DH5α懸液中加入上述連接產(chǎn)物，加入SOC培養(yǎng)液培養(yǎng)；8)在LB瓊脂平板上涂布接種上述SOC培養(yǎng)物；9)選取SOC培養(yǎng)物上的白色菌落在含LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，采用細(xì)菌質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取，提取的質(zhì)粒進(jìn)行Nde?I和XhoI酶切、電泳分離，在紫外線下分別確認(rèn)有目的DNA片段lipL32/1、lipL21或ompL1/2后，測(cè)定克隆片段的核苷酸序列，序列正確者即為重組質(zhì)粒pUC-M-T^lipL32/1、pUC-M-T^lipL21或pUC-M-T^ompL1/2。