[發明專利]提供作物廣譜病毒抗性的包含木瓜環斑病毒輔助組分蛋白酶基因的基因轉移載體及其應用

有效

• 申請號: 201010203078.5
• 申請日: 2010-06-10
• 公開（公告）號: CN102277376A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發明（設計）人: 葉錫東;龔怡蓉;王惠菁;王馨蘭
• 申請（專利權）人: 葉錫東;龔怡蓉;王惠菁;王馨蘭
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N1/21;C12N15/57;C12N5/10;A01H5/00;C12R1/01
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司 72002
• 代理人: 林曉紅

技術領域

本發明涉及一種用于提供植物對于病毒的抗性的重組載體，其包含木瓜環斑病毒輔助組分蛋白酶基因(Papaya?ringspot?virus?helper-componentprotease?gene，PRSV?HC-Pro?gene)的編碼序列片段。本發明也涉及一種重組微生物。本發明也涉及一種用于使植物對病毒具有抗性的方法。本發明也涉及輔助組分蛋白酶的全長基因或其基因片段用于制造對病毒具有抗性的植物的用途。?

背景技術

木瓜(Carica?papaya?L.)為具有高度經濟價值的作物，其病毒病害并無藥劑可以治療，近年來由于植物組織培養技術的提高，植物轉基因技術的突破，加上病原誘導抗性理論(pathogen-derived?resistance，PDR)(Sanford?andJohnson?1985)的啟示，將病毒基因組的一部分轉移至宿主植物染色體內，已達到抗病毒感染的目的，已成為目前熱門的方法。Fitch等人(Fitch?et?al.，1992)首先將PRSV夏威夷分離株的CP基因以微粒轟擊(microprojectilebombardment)的方式轉入木瓜中，但他們的轉基因木瓜對于臺灣系統的PRSV永康分離株(YK?isolate)不具抗性，其依賴序列同源性的抗性成為此轉基因木瓜在其他地區應用的限制因素。?

申請人以前將臺灣PRSV?YK分離株的外殼蛋白(coat?protein，CP)基因以農桿菌(Agrobacterium?sp.)轉移方式獲得轉基因木瓜株系(Cheng，1996)，經攻擊接種、分析后，證明這些轉基因木瓜株系除了對臺灣PRSVYK具有良好抗性外，對其他不同地區較疏遠的PRSV病毒如夏威夷(HA)、墨西哥(MX)及泰國(TH)分離株也均有良好的抗性(Bau?et?al.，2003)。顯示YK的外殼蛋白轉基因木瓜對于PRSV提供很高程度的抗性(Bau?et?al.2004)。現有技術借助對外殼蛋白轉基因木瓜的應用，雖然可得到抗病的轉基因植物，其抗性原理為轉移的CP基因激發木瓜防御反應作用的轉錄后基因沉默機制(post-transcriptional?gene?silencing，PTGS)，使得木瓜產生分解入侵的PRSVRNA基因組的能力，而具有病毒抗性。但此原理有序列同源性專一性問題，?對于CP基因較疏遠的PRSV不具抗性，這種病毒株系專一性抗性的缺點仍是普遍存在的問題(Tennant?et?al.2001)，因此由不同株系病毒的外殼蛋白轉基因植物僅具有區域性的應用價值。?

申請人的研究團隊利用農桿菌介導(Agrobacterium-mediated)的手段，將臺灣PRSV?YK系統的外殼蛋白基因導入木瓜未成熟胚中(Cheng?et?al.1996)，得到對PRSV具不同程度抗性的株系，并且篩選出數個株系除了對本土的YK系統具良好抗性外，還對源自于夏威夷(HA)、泰國(TH)及墨西哥(MX)等不同地域的病毒均有良好的抗性(Bau?et?al.2003)。所得到的PRSVYK系統的外殼蛋白轉基因木瓜株系經田間試驗證實對于PRSV提供很高程度的抗性(Bau?et?al.2004)。?

申請人于PRSV?YK系統的外殼蛋白轉基因木瓜的田間試驗期間發現，結果發現PRSV?YK外殼蛋白轉基因木瓜會被超強的木瓜環斑病毒株擊垮，而探討其可擊垮由外殼蛋白基因介導的抗性的原因為病毒蛋白輔助組分蛋白酶(helper-component?protease，HC-Pro)造成。HC-Pro為基因沉默阻抑物(suppressor)，其具有抑制轉錄后基因沉默作用的能力(Anadalakshmi?et?al.，1998；Brigneti?et?al.，1998；Shi?et?al.，1997)，申請人推測PRSV?5-19的HC-Pro的抑制基因沉默的能力超強，可使得PRSV?YK?CP轉基因木瓜的基因沉默機制被5-19HC-Pro所抑制，而無法發揮作用，從而使得轉基因木瓜的抗性被抑制而失效。基于單獨以外殼蛋白基因來提供抗性已不足以對付超強病毒株系(super?virus?strain)的事實，本技術領域特發展出對付超強病毒的新的轉基因策略。?

發明內容