[發(fā)明專利]淫羊藿苷單克隆抗體及其制備方法與應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010202542.9
• 申請日: 2010-06-13
• 公開（公告）號: CN101885773A
• 公開（公告）日: 2010-11-17
• 發(fā)明（設計）人: 徐金森;許方美
• 申請（專利權）人: 廈門大學
• 主分類號: C07K16/44
• 分類號: C07K16/44;C07K14/765;C12N5/20;G01N33/577;C07H17/07;C07H1/08;C07H1/06
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所 35200
• 代理人: 馬應森

技術領域

本發(fā)明涉及一種淫羊藿苷單克隆抗體，尤其是涉及一種淫羊藿苷單克隆抗體及其制備方法與應用。

背景技術

淫羊藿是一味常用的補腎壯陽傳統(tǒng)中藥，藥用歷史悠久。現代生物醫(yī)學研究表明，淫羊藿具有強身健骨、保護心血管、抗氧化衰老、抗腫瘤等藥理作用。淫羊藿苷(Icariin，ICA)是淫羊藿的主要藥理活性成分，屬于黃酮醇苷類化合物，藥理作用廣泛，是一種很有開發(fā)前景的新型藥物([10]郭寶林，斐利寬，肖培根.淫羊藿屬植物黃酮類化合物的分類學意義再探.植物分類學報，2008，46(6)：874-885)。淫羊藿苷也是淫羊藿藥材及含淫羊藿苷中成藥的重要質量指標之一。目前，已有多種檢測方法，但主要是高效液相色譜(HPLC)方法，并且是中國藥典目前推薦方法。然而HPLC方法也有不利之處，如儀器昂貴，因而投入較大(動輒數十萬元人民幣)，樣品預處理的提取溶液較大，耗時較多，尤其是當待測成分的含量很低且樣品數很大時。

近年來，國內外研究者將免疫分析技術引入到藥用植物活性成分的分析研究中，并取得了若干成果([21]徐金森MALDI-TOF-MS法測定芍藥苷-人血清白蛋白復合物的半抗原數.廈門大學報(自然科學版)，2006，45(增刊)：54-56)。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種淫羊藿苷單克隆抗體及其制備方法與應用。

本發(fā)明所述淫羊藿苷單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：

1)合成人工抗原ICA-BSA

(1)將ICA溶于80％MeOH溶液，將NaIO₄溶于50％MeOH溶液，把ICA溶液加入到NaIO₄溶液中，混勻，遮光攪拌；

(2)將BSA溶于0.05mol/L?CB緩沖液，然后加入到ICA-NaIO₄反應溶液中，混勻，用NaHCO₃溶液將pH調節(jié)至9.0，遮光攪拌6h；

(3)加入NaBH₄，遮光攪拌；

(4)將反應溶液經0.01mol/L?PBS緩沖液透析，再用蒸餾水透析后，凍干，制得合成產物即為人工抗原ICA-BSA；

2)小鼠免疫

初次免疫使用弗氏完全佐劑與免疫人工抗原混合乳化，每只小鼠注射100μL，之后每隔2周繼續(xù)加強免疫小鼠，加強免疫4～5次，待小鼠血清的抗體效價合適，則行脾臟注射進行沖擊免疫方式，且3天后進行對小鼠斷頸處死、取脾臟細胞進行融合操作；

3)細胞融合與雜交瘤篩選

使用PEG?1450介導免疫脾細胞與SP2/0融合，骨髓瘤細胞與脾細胞的數目比例為1∶(5～10)，置CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，采用有限稀釋法篩選、分離目標單克隆雜交瘤，通過添加含HAT的RPMI?1640完全培養(yǎng)液，將陽性單克隆孔的雜交瘤依次轉移至24孔細胞培養(yǎng)板、6孔細胞培養(yǎng)板和10cm培養(yǎng)皿，同時以ELISA方法鑒別、確保擴增的雜交瘤能夠持續(xù)分泌抗體；

將陽性孔雜交瘤細胞轉移至24孔細胞板培養(yǎng)，使用添加HAT的RPMI?1640完全培養(yǎng)液，恢復雜交瘤細胞的快速增殖能力，挑取陽性孔重復有限稀釋培養(yǎng)，最終獲得具備穩(wěn)定增殖能力，大量分泌特異性抗體的單克隆細胞株。

4)雜交瘤細胞的量產、純化及其鑒定

采用腹水制備的方法，生產單克隆抗體的雜交瘤細胞和目的抗體，采用6～8周齡的Bulb/c小鼠，腹腔注射滅菌液體石蠟(0.5mL/只)后一周注射1.0mL/只雜交瘤細胞懸浮液(平均1.5x10⁶cell/mL)；

再引頸處死小鼠，收集腹水，離心0.45μm微孔濾膜過濾，并采用Protein?G親和層析柱純化目的抗體，透析、凍干樣品；

取凍干抗體樣品和未純化腹水跑SDS-PAGE凝膠電泳，測定純度及分子量，同時也利用MALDI-TOF-MS法測定單抗的分子量，以互為應證；

5)單抗的性質鑒定

對獲得的淫羊藿單抗(ICA-MAb)的性質進行交叉反應率、敏感度和親和力等的測定；

(1)ICA-MAb的交叉反應率

采用競爭ELISA法測定單抗的交叉反應率，對若干與淫羊藿苷分子結構類似的黃酮類化合物葛根素(puerarin)，槲皮素(quercetin)，蘆丁(rutin)，大黃酸(rhein)，大豆苷元(daidzein)，黃芩苷(baicalin)，黃芩素(baicalein)與淫羊藿苷的可能發(fā)生的交叉反應率進行了測定并比較；

(2)ICA-MAb的抗體敏感度