[發明專利]淫羊藿苷單克隆抗體及其制備方法與應用

無效

• 申請號: 201010202542.9
• 申請日: 2010-06-13
• 公開（公告）號: CN101885773A
• 公開（公告）日: 2010-11-17
• 發明（設計）人: 徐金森;許方美
• 申請（專利權）人: 廈門大學
• 主分類號: C07K16/44
• 分類號: C07K16/44;C07K14/765;C12N5/20;G01N33/577;C07H17/07;C07H1/08;C07H1/06
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所 35200
• 代理人: 馬應森

1.淫羊藿苷單克隆抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

1)合成人工抗原ICA-BSA

(1)將ICA溶于80％MeOH溶液，將NaIO₄溶于50％MeOH溶液，把ICA溶液加入到NaIO₄溶液中，混勻，遮光攪拌；

(2)將BSA溶于0.05mol/L?CB緩沖液，然后加入到ICA-NaIO₄反應溶液中，混勻，用NaHCO₃溶液將pH調節至9.0，遮光攪拌6h；

(3)加入NaBH₄，遮光攪拌；

(4)將反應溶液經0.01mol/L?PBS緩沖液透析，再用蒸餾水透析后，凍干，制得合成產物即為人工抗原ICA-BSA；

2)小鼠免疫

初次免疫使用弗氏完全佐劑與免疫人工抗原混合乳化，每只小鼠注射100μL，之后每隔2周繼續加強免疫小鼠，加強免疫4～5次，待小鼠血清的抗體效價合適，則行脾臟注射進行沖擊免疫方式，且3天后進行對小鼠斷頸處死、取脾臟細胞進行融合操作；

3)細胞融合與雜交瘤篩選

使用PEG?1450介導免疫脾細胞與SP2/0融合，骨髓瘤細胞與脾細胞的數目比例為1∶(5～10)，置CO₂培養箱中培養，采用有限稀釋法篩選、分離目標單克隆雜交瘤，通過添加含HAT的RPMI?1640完全培養液，將陽性單克隆孔的雜交瘤依次轉移至24孔細胞培養板、6孔細胞培養板和10cm培養皿，同時以ELISA方法鑒別、確保擴增的雜交瘤能夠持續分泌抗體；

將陽性孔雜交瘤細胞轉移至24孔細胞板培養，使用添加HAT的RPMI?1640完全培養液，恢復雜交瘤細胞的快速增殖能力，挑取陽性孔重復有限稀釋培養，最終獲得具備穩定增殖能力，大量分泌特異性抗體的單克隆細胞株；

4)雜交瘤細胞的量產、純化及其鑒定

采用腹水制備的方法，生產單克隆抗體的雜交瘤細胞和目的抗體，采用6～8周齡的Bulb/c小鼠，腹腔注射滅菌液體石蠟后一周注射1.0mL/只雜交瘤細胞懸浮液；

再引頸處死小鼠，收集腹水，離心0.45μm微孔濾膜過濾，并采用Protein?G親和層析柱純化目的抗體，透析、凍干樣品；

取凍干抗體樣品和未純化腹水跑SDS-PAGE凝膠電泳，測定純度及分子量，同時也利用MALDI-TOF-MS法測定單抗的分子量，以互為應證；

5)單抗的性質鑒定

對獲得的淫羊藿單抗的性質進行交叉反應率、敏感度和親和力等的測定；

(1)ICA-MAb的交叉反應率

采用競爭ELISA法測定單抗的交叉反應率，對若干與淫羊藿苷分子結構類似的黃酮類化合物葛根素，槲皮素，蘆丁，大黃酸，大豆苷元，黃芩苷，黃芩素與淫羊藿苷的可能發生的交叉反應率進行了測定并比較；

(2)ICA-MAb的抗體敏感度

繪制抑制率-ICA標準品濃度對數的標準曲線，以抑制率達到50％時所對應的ICA濃度為單抗的靈敏度；

(3)ICA-MAb的抗體親和力

親和常數通過間接競爭ELISA法測定。

2.如權利要求1所述的淫羊藿苷單克隆抗體的制備方法制備的淫羊藿苷單克隆抗體。

3.如權利要求2所述的淫羊藿苷單克隆抗體在對淫羊藿中藥及其中成藥內的淫羊藿苷含量進行檢測和評價中的應用。

4.如權利要求2所述的淫羊藿苷單克隆抗體在淫羊藿苷的親和層析柱分離純化、中藥復方中的應用。