[發明專利]一種取代單克隆抗體親和層析的分離純化重組人干擾素α1b的方法

有效

• 申請號: 201010202366.9
• 申請日: 2010-06-13
• 公開（公告）號: CN101885767A
• 公開（公告）日: 2010-11-17
• 發明（設計）人: 何社輝;何毅華;陳克堯;何詢
• 申請（專利權）人: 深圳科興生物工程有限公司
• 主分類號: C07K14/56
• 分類號: C07K14/56;C07K1/22;C07K1/20;C07K1/18;C07K1/16
• 代理公司: 深圳市睿智專利事務所 44209
• 代理人: 陳鴻蔭

技術領域??本發明涉及含肽的醫藥配制品，特別是涉及蛋白質的分離純化技術，尤其是涉及取代單克隆抗體親和層析的分離純化重組人干擾素α1b的方法。

背景技術??干擾素(IFN)是一種廣譜抗病毒劑，并不直接殺傷或抑制病毒，其主要是通過細胞表面受體作用使細胞產生抗病毒蛋白，從而抑制乙肝病毒的復制；同時還可增強自然殺傷細胞(NK細胞)、巨噬細胞和T淋巴細胞的活力，從而起到免疫調節作用，并增強抗病毒能力。它們在同種細胞上具有廣譜的抗病毒、影響細胞生長，以及分化、調節免疫功能等多種生物活性。目前，干擾素已經廣泛應用于臨床，在傳染病領域，IFN-α主要用于慢性乙型肝炎、丙型肝炎的治療。根據干擾素蛋白質的氨基酸結構、序列的同源性、抗原性和細胞來源，干擾素可分為I型與II型，II型只包括一個成員，即IFN-γ，而I型干擾素則是多基因家族，包括IFN-α、IFN-β、IFN-ω等。現在公認IFN-β和IFN-γ只有一個亞型，而IFN-α有約二十余個亞型。

中國科學家的研究發現，中國人白細胞經病毒刺激后，誘生的所有干擾素中最主要的亞型是α1b，所以α1b更符合中國人的自然狀態。候云德教授等人于1982年成功克隆了人IFNα1b基因，并在大腸桿菌中實現高效表達，使干擾素產業化成為可能。IFN-α1包括IFN-α1a、IFN-α1b、IFN-α1c、IFN-α1d等亞型。這些亞型相互之間僅相差一個或兩個氨基酸。IFN-α1b僅在中國獲得批準上市使用，國外只有IFN-α2a和IFN-α2b兩個亞型獲準在臨床使用，沒有IFN-α1b，因此，國內外對IFN-α1b的生產工藝研究并不多。

專利申請號為CN200410069391.9的專利文獻公開了一種重組人干擾素α1b的純化工藝方法，從該專利申請獲知，其重組人干擾素α1b在質粒構建時，使用的載體與之前的可溶性表達菌種使用的載體不一樣，其工程菌在發酵表達過程中，形成包涵體，而不是大腸桿菌胞內可溶表達，其純化過程包括包涵體離心、沉淀、包涵體變性和包涵體復性等步驟。其疏水柱層析使用Phenyl?Sepharose?FF，分辨率不高，使用鹽梯度洗脫，不能分離重組人干擾素α1b相關蛋白質、異構體。

本申請人的中國發明專利ZL200410050936.1公開了一種重組人干擾素α1b的純化工藝方法。其特征是利用擴張床吸附、單克隆抗體親和層析等步驟分離純化可溶性表達的重組人干擾素α1b。這種利用單克隆抗體親和層析的方法具有昂貴、可能有鼠IgG脫落等不足，該方法獲得的重組人干擾素α1b原液用分子篩高效液相色譜法(SEC-HPLC)檢測只有一個主峰，但是用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)檢測有兩個或兩個以上的主峰，即重組人干擾素α1b峰及重組人干擾素α1b相關蛋白/異構體峰。這種原液符合《中國藥典》的標準，但如果參考《歐洲藥典》的標準，則達不到單一主峰純度的標準。因此，急需發明新的方法，以獲得符合類似《歐洲藥典》干擾素α標準的重組人干擾素α1b，滿足臨床應用的需要。

綜上，現有技術的干擾素生產存在以下缺陷：生產工藝步驟復雜；強酸強堿處理使得蛋白得率很低；單抗親和雖然具有高選擇性，但單抗膠價格昂貴，使用次數有限，且容易脫落造成產品污染；現有技術生產的干擾素原液經RP-HPLC檢測，存在兩個主峰，一個為干擾素α1b，另外一個為干擾素α1b的相關蛋白質、異構體。為了克服現有技術工藝的不足，提高生產效率，很有必要探索一種新的干擾素純化工藝。

發明內容??本發明要解決的技術問題在于避免上述現有技術的不足之處，而對現有技術做進一步的改進，提出一種能夠提高生產效率和原液質量，又能降低生產成本的取代單克隆抗體親和層析的分離純化重組人干擾素α1b的方法。

本發明解決所述技術問題實際采用的技術方案是：提出一種取代單克隆抗體親和層析的分離純化重組人干擾素α1b的方法，用于從可溶性表達重組人干擾素α1b的大腸桿菌工程菌中提取重組人干擾素α1b，包括如下步驟：

A.利用高壓勻漿機破碎含有重組人干擾素α1b的菌體；

B.將步驟A獲得的破碎菌體上樣至Streamline擴張床吸附柱，使用NaCl鹽梯度洗脫或一步法洗脫得到目標蛋白，優選采用一步法洗脫；

C.將步驟B處理后得到的目標蛋白添加NaCl到2M至2.5M，經疏水柱層析，高鹽濃度上樣、低鹽濃度洗脫；

D.將步驟C處理后得到目標蛋白經陰離子柱層析，利用緩慢的pH梯度將重組人干擾素α1b與其相關蛋白質、異構體分離；

E.采用Sephacryl凝膠過濾層析，去除高分子蛋白，獲得重組人干擾素α1b原液。