[發明專利]紫色葉脈融合基因及其作為可視篩選標記基因在植物轉基因技術中的應用

有效

• 申請號: 201010202122.0
• 申請日: 2010-06-18
• 公開（公告）號: CN101892224A
• 公開（公告）日: 2010-11-24
• 發明（設計）人: 王寧寧;黨利潔;金鳳;李鵬麗;柴文婷
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 天津佳盟知識產權代理有限公司 12002
• 代理人: 侯力

【技術領域】：本發明屬于植物基因工程領域，具體地說是用擬南芥的葉脈特異性VS啟動子與番茄花氰苷合成途徑的調節基因構建PL2融合基因及其作為可視篩選標記基因在植物轉基因技術中的應用。

【背景技術】：植物轉基因技術是利用重組DNA技術將克隆的優良目的基因導入植物細胞或組織，并在其中進行表達，從而使植物獲得新的性狀。轉基因作物可提高農作物的產量，提高植物中有益成分的含量，改變植物的顏色，減少除草劑、殺蟲劑等農藥的使用量等，并節省大量人力，因而給人類社會帶來了巨大的經濟和社會效益。但同時轉基因植物的安全性也在全球范圍內引起了激烈的爭論與普遍關注，其中由于目前的轉基因技術常通過使用抗抗生素類或抗除草劑類選擇性篩選標記來進行轉基因植物的篩選，這些選擇性篩選標記基因最終會與目的基因一同整合到植物的基因組中，成為影響轉基因植物安全性的主要因素之一。解決轉基因植物中抗性標記基因安全性問題有兩個途徑：(1)轉化時仍使用抗性標記基因，獲得轉基因植物以后，再將其基因組中的抗性標記基因刪除。但這種方法步驟繁瑣、獲得無標記轉基因植株的周期較長；(2)發展安全性標記基因用于植物遺傳轉化，而利用顏色作為安全性可視篩選標記將是一個很有前景的研究方向。另一方面，各國在世界貿易活動中為保證本國經濟利益不被侵害，對轉基因植物及產品的檢測是必不可少的。同樣，在對轉基因生物安全管理過程中，是否發生基因漂移等是生態環境安全檢測的一個重要方面。目前這些方面的檢測多使用轉基因成分分析方法，主要有DNA檢測法和蛋白質檢測法兩類(楊建霞，2004)。此外，基因芯片技術已開始應用于轉基因植物的檢測。而這些方法無疑都需要投入較大的人力物力成本。如果能在轉基因植物中引入安全、持久、可視的篩選標記，將可以利用顯著可視的性狀直接區分轉基因和非轉基因植物，以及判斷是否發生基因漂移等，將可以大大降低轉基因生物安全檢測的投入和成本。

在整個植物界幾乎所有的植物的葉片都表現出綠色，而花和果實則呈現出五顏六色，這和植物的葉片、花、果實中的色素成分以及含量不同有關，葉綠素在葉片中占主導地位，而在花和果實中，花氰苷的含量遠遠超過葉綠素，從而賦予植物花和果實各種各樣的顏色。花氰苷是花青素與各種單糖結合而形成的黃酮多酚類化合物。它是植物合成的一類次生代謝物，能控制植物從紅到紫甚至是藍的一系列變化，主要積累在植物表皮細胞的液泡內。前期研究表明，一些轉錄調節因子對植物花氰苷的合成具有調控作用。例如：Elomaa等(Elomaa?et?al.，2003)將大丁草轉錄調節因子基因GMYB10置于CaMV35S啟動子之下轉入煙草中，轉基因植株徑、葉、花萼、花粉囊、子房壁均較對照積累大量花色素苷，顏色發生改變。Quattrocchio等(Quattrocchio?et?al.，1999)將玉米的C1和Lc基因轉入矮牽牛之后，得到紅色的愈傷組織和粉紅色花冠。這些結果表明花氰苷合成的控制因子可以異源發揮對花氰苷合成的調控作用。

組織或器官特異性啟動子能夠調控目的基因在特定的組織或器官表達，在植物基因工程技術中，可以利用組織或器官特異性啟動子有針對性地、特異、高效地調控目的基因的表達。葉脈位于植物地上部的葉片內，由貫穿在葉肉內的維管組織組成，是葉的輸導和支持結構。我們設想：如果獲得能夠驅動目的基因在葉脈中特異性表達的啟動子，在植物基因工程技術中利用此類啟動子有針對性地在葉脈中特異性表達導致或促進花氰苷合成的關鍵基因，則可以將因花氰苷的特異性積累所呈現的葉脈顏色變化特征(如紫色葉脈)，作為植物轉基因技術中的一種可視性篩選標記。據此建立的新型植物轉化技術體系，不但能夠解決傳統的篩選標記可能給轉基因植物帶來的安全性問題，還可以把這種可視的篩選標記應用于轉基因植物的環境安全等檢測工作中，以是否具有有色葉脈作為轉基因和非轉基因植物的區分標記，簡單易行，將大大降低轉基因植物檢測的成本，勢必在轉基因植物新品種的實際應用過程中發揮巨大作用。