[發明專利]紫色葉脈融合基因及其作為可視篩選標記基因在植物轉基因技術中的應用

有效

• 申請號: 201010202122.0
• 申請日: 2010-06-18
• 公開（公告）號: CN101892224A
• 公開（公告）日: 2010-11-24
• 發明（設計）人: 王寧寧;黨利潔;金鳳;李鵬麗;柴文婷
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 天津佳盟知識產權代理有限公司 12002
• 代理人: 侯力

1.一種紫色葉脈融合基因，簡稱PL2融合基因，其核酸序列如序列表1所示；該融合基因是利用擬南芥的葉脈特異性啟動子簡稱VS啟動子與番茄花氰苷合成途徑的調節基因構建而成的。

2.一種紫色葉脈融合基因，其特征在于，是與權利要求1所述核酸序列有85％以上的同源性的核酸分子。

3.一種紫色葉脈融合基因，其特征在于，利用如權利要求1所述方法，將葉脈或維管束特異性啟動子與導致或促進紫色產生的功能基因融合所獲得的、可使轉基因植物產生紫色葉脈的融合基因。

4.根據權利要求1所述的紫色葉脈融合基因，其特征在于，所設計的VS啟動子的PCR擴增引物如下，其中上游引物中引入KpnI酶切位點，下游引物中引入Bgl?II和Sal?I酶切位點：

上游引物：5’-GGTACCTCGACGCGTGAGAGTTTCCGGC-3’

下游引物：5’-AGATCTGTCGACATTTGCTGTGTCAATTCTCACTTC-3’

其中上、下游引物所引入酶切位點可根據所選擇的雙元表達載體上的多克隆位點進行更換；本發明所選用雙元表達載體為pCAMBIA1301，是目前常用的商品化載體。

5.根據權利要求1所述的紫色葉脈融合基因，其特征在于，所設計的PL2融合基因的結構基因部分的PCR擴增引物如下，其中上游引物中引入SalI酶切位點，下游引物中引入BstEII酶切位點：

上游引物：5’-GTCGACCATGAACAGTACATCTATGTCTTCAT-3’

下游引物：5’-GGTCACCTTAATCAAGTAGATTCCATAAGTCA-3’

其中上、下游引物所引入酶切位點可根據所選擇的雙元表達載體上的多克隆位點進行更換；本發明所選用雙元表達載體為pCAMBIA1301，是目前常用的商品化載體。

6.根據權利要求1所述的紫色葉脈融合基因，其特征在于，構建PL2融合基因的具體操作步驟如下：

(1)以擬南芥基因組DNA為模板，用PCR方法擴增VS啟動子部分，回收擴增產物并進行TA克隆；

(2)用Kpn?I/Bgl?II雙酶切上述(1)步所獲得的含有VS啟動子的TA克隆質粒和pCAMBIA1301質粒，分別回收啟動子片段和載體大片段；

(3)將上述兩個片段混合，在連接酶催化下進行連接反應，獲得中間構建“VS啟動子-GUS”融合基因；

(4)以番茄基因組DNA為模板，用PCR方法擴增PL2融合基因的結構基因部分，回收擴增產物并進行TA克隆；

(5)用Sal?I/BstE?II雙酶切上述(4)步所獲得的含有PL2融合基因結構基因的TA克隆質粒和上述(3)步所獲得的含有“VS啟動子-GUS”融合基因的中間構建質粒，分別回收結構基因片段和大的載體片段；

(6)將上述(5)步回收的兩個片段混合，在連接酶催化下進行連接反應，即完成在pCAMBIA1301載體上的擬南芥VS啟動子-番茄花氰苷合成途徑調節基因，即PL2融合基因的構建。

7.根據權利要求1、2或3所述的紫色葉脈融合基因作為可視篩選標記基因在植物轉基因技術中的應用，其特征在于，用帶有PL2融合基因的載體轉化植物，用紫色葉脈作為可視篩選標記，可獲得含有本發明融合基因序列及載體上同時含有的其他目的片段的轉基因植物。