[發明專利]人源基質金屬蛋白酶-13的激活劑檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201010201875.X
• 申請日: 2010-06-09
• 公開（公告）號: CN101870999A
• 公開（公告）日: 2010-10-27
• 發明（設計）人: 楊林;郭艾
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學附屬北京友誼醫院
• 主分類號: C12Q1/37
• 分類號: C12Q1/37
• 代理公司: 北京北新智誠知識產權代理有限公司 11100
• 代理人: 程鳳儒

技術領域

本發明涉及一種檢測試劑盒，具體地說是一種人源基質金屬蛋白酶-13激活劑檢測試劑盒。

背景技術

骨性關節炎(OA)是導致50歲以上人群功能殘疾、造成經濟損失和影響社會發展的主要疾病之一，目前發現有多種因素參與發病，但主要病因和具體發病機制不明。其病理本質在于關節軟骨細胞、細胞外基質方面發生了更微觀的改變，宏觀上的損傷是微觀改變的一個外因。關節軟骨基質中最具特征，含量最多的是II型膠原。基質金屬蛋白酶(MMPs)是一類廣泛存在于各結締組織中，在細胞外基質的生理性和病理性降解過程中起重要作用的蛋白酶超家族。其中MMP-13在OA關節軟骨中表達，并且特異性降解II型膠原，而且其他許多MMP亞型對II型膠原的降解需要通過它們起作用，成為目前重點研究的靶向分子。MMP-13以無活性的形式被合成，保守序列中不配對的半胱氨酸殘基具有開關作用，它可與活性部位的鋅離子形成配位鍵，使酶處于無活性狀態，在細胞外的N末端前肽被其他分子切掉后而得以激活。MMP-13可以被白細胞介素、腫瘤壞死因子等激活。除此之外，還有許多分子可能有激活MMP-13的作用，需要進一步研究。本試劑盒適用于醫學研究中篩查MMP-13的激活劑，為研究OA的發病機制服務。

目前，用于檢測MMP-13的激活劑的方法包括核素檢測法和熒光檢測法，二者分別用核素和熒光素標記膠原底物，MMP-13被激活后分解底物釋放核素射線或熒光，通過檢測射線強度或熒光強度來間接分析MMP-13的活性。核素檢測法的主要缺陷：核素放射性對人體有輻射傷害；核素自身的衰減性造成使用期限有限，不能長期保存備用；核素自身的不穩定性造成實驗結果系統誤差較大；需要專門的射線檢測儀器。熒光檢測法的主要缺陷：熒光素自身的淬滅性造成使用期限有限，不能長期保存備用；熒光素自身的不穩定性造成實驗結果系統誤差較大；熒光強度較弱，需要高靈敏度的熒光檢測儀器。

因此，本領域技術人員急需一種可以有效的避免上述技術缺陷而做出的一種可以準確檢測MMP-13激活劑的方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種檢測人源基質金屬蛋白酶-13的激活劑的方法和檢測試劑盒。

為了實現上述目的，本發明的發明思路為：

將II型膠原底物制成纖維薄膜，覆蓋并固定于棕色的96孔板上，再將無活性的MMP-13加入微孔內，最后將待測因子加入其中，若MMP-13被激活就會分解膠原纖維薄膜，觀察纖維薄膜的破損程度即可分析MMP-13的活性，從而判斷該因子對MMP-13的激活作用。

為了實現上述目的，本發明采用如下具體技術方案：

一種人源基質金屬蛋白酶-13的激活劑檢測試劑盒，所述試劑盒組分如下：

MMP-13?10-15微克，最佳為10微克；

胰蛋白酶1-1.5毫升，最佳為1毫升；

緩沖液60-100毫升，最佳為60毫升；

反應終止液1-1.5毫升，最佳為1毫升；

覆蓋膠原纖維膜的96孔板2塊。

所述緩沖液為50mM?Tris-HCl(pH?9.025℃)、1.5mM?MgCl₂、15mM(NH₄)₂SO₄、0.1％Triton?X-100。

所述反應終止液10mM鄰二氮雜菲。

上述試劑盒的推薦使用方法為：

(1)將覆蓋膠原纖維膜的棕色96孔板分為空白組、陽性對照組和實驗組。

(2)按1∶10用緩沖液稀釋MMP-13，給所有孔各加10微升稀釋后的MMP-13和80微升緩沖液。

(3)空白組加10微升緩沖液，陽性對照組加10微升胰蛋白酶，實驗組加10微升待測因子，37℃下孵育90分鐘。

(4)給所有孔各加10微升反應終止液。

(5)沖洗微孔板后用數碼相機拍照，再用圖像分析軟件觀察膠原纖維膜的消化程度并進行比較。

待測因子包括S-亞硝基-N-乙酰基青霉胺、核因子(NF)-κB、IL-6、IL-8、NOC-9，6-(2-羥基-1-甲基-2-亞硝基肼基)-N-甲基-1-正己胺(NOC-9，6-(2-Hydroxy-1-methyl-2-nitroso-hydrazino)-N-methyl-1-hexanamine)、S-亞硝基(S-nitrosoglutathione)、醋酸氨基苯汞(APMA)或硝普鈉等。

除了96孔板外，還可以使用48孔板和24孔板。

本發明的優點與效益：