[發(fā)明專利]人源基質(zhì)金屬蛋白酶-13的激活劑檢測(cè)試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010201875.X
• 申請(qǐng)日: 2010-06-09
• 公開（公告）號(hào): CN101870999A
• 公開（公告）日: 2010-10-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊林;郭艾
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12Q1/37
• 分類號(hào): C12Q1/37
• 代理公司: 北京北新智誠知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11100
• 代理人: 程鳳儒

1.一種人源基質(zhì)金屬蛋白酶-13的激活劑檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒組分如下：

無活性重組人MMP-1310-15微克；

胰蛋白酶1-1.5毫升；

緩沖液60-100毫升；

反應(yīng)終止液1-1.5毫升；

覆蓋膠原纖維膜的96孔板。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人源基質(zhì)金屬蛋白酶-13的激活劑檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述緩沖液為50mM?Tris-HCl(pH?9.025℃)、1.5mM?MgCl₂、15mM(NH₄)₂SO₄、0.1％Triton?X-100。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人源基質(zhì)金屬蛋白酶-13的激活劑檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述反應(yīng)終止液10mM鄰二氮雜菲。

4.一種檢測(cè)人源基質(zhì)金屬蛋白酶-13的激活劑的方法，其特征在于，將II型膠原底物制成膠原纖維薄膜，覆蓋并固定于載體上，將無活性重組人MMP-13及待測(cè)因子加入所述載體，MMP-13被激活的情況下，膠原纖維薄膜被分解，觀察膠原纖維薄膜的破損程度，分析所述MMP-13的活性，判斷該待測(cè)因子對(duì)所述MMP-13的激活作用。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)人源基質(zhì)金屬蛋白酶-13的激活劑的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

(1)將II型膠原纖維薄膜覆蓋固定于載體上；

(2)覆蓋膠原纖維膜的載體分為空白組、陽性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組；

(2)用緩沖液稀釋無活性MMP-13；

(3)加10微升待測(cè)因子，37℃下孵育90分鐘；

(4)加反應(yīng)終止液終止反應(yīng)；

(5)用數(shù)碼相機(jī)拍照，膠原纖維膜被MMP-13消化后破損，膜下載體顯露，用圖像分析軟件計(jì)算顯露面積，即表示MMP-13的活性大小。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)人源基質(zhì)金屬蛋白酶-13的激活劑的方法，其特征在于，所述載體為棕色96孔板、48孔板或24孔板。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)人源基質(zhì)金屬蛋白酶-13的激活劑的方法，其特征在于，所述空白組加用緩沖液稀釋的MMP-13及緩沖液。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)人源基質(zhì)金屬蛋白酶-13的激活劑的方法，其特征在于，所述陽性對(duì)照組加胰蛋白酶和用緩沖液稀釋MMP-13。

9.根據(jù)權(quán)利要求4至8中任意一項(xiàng)所述的檢測(cè)人源基質(zhì)金屬蛋白酶-13的激活劑的方法，其特征在于，所述緩沖液為50mM?Tris-HCl(pH?9.025℃)、1.5mM?MgCl₂、15mM(NH₄)₂SO₄、0.1％Triton?X-100；所述反應(yīng)終止液10mM鄰二氮雜菲。

10.根據(jù)權(quán)利要求4至8中任意一項(xiàng)所述的檢測(cè)人源基質(zhì)金屬蛋白酶-13的激活劑的方法，其特征在于，所述待測(cè)因子包括S-亞硝基-N-乙酰基青霉胺、核因子(NF)-κB、IL-6、IL-8、NOC-9，6-(2-羥基-1-甲基-2-亞硝基肼基)-N-甲基-1-正己胺、S-亞硝基、醋酸氨基苯汞或硝普鈉等。